硫氧還蛋白5在精索靜脈曲張大鼠睪丸中的表達及意義*

程 隆 朱智榮 唐桂良

1 紹興文理學院醫學院，浙江省紹興市 312000； 2 浙江大學紹興醫院

精索靜脈曲張(Varicocele，VC)是指睪丸蔓狀靜脈叢迂曲擴張、伸長的一種病理現象。精索靜脈曲張具有發病率高、早期不易發現等特點，是引起我國男性不育的常見疾病之一[1-3],但其具體機制尚未清楚。目前研究發現氧化應激(Oxidative stress，OS)可產生過量的活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)直接破壞精子細胞，導致睪丸組織損傷[4]。硫氧還蛋白5 (Thioredoxin domain containingprotein 5，TXNDC5) 是近年來發現上皮PDI家族成員之一[5],其對缺氧的內皮細胞具有保護作用，可對抗VC發生發展過程中的氧化應激損傷[6-7]。這些研究對OS導致精索靜脈曲張提供了一個嶄新的思路。本研究通過構建左側VC大鼠模型和精索靜脈曲張高位結扎術后大鼠模型，旨在探究TXNDC5在OS導致睪丸組織損傷中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 30只7周齡雄性SD大鼠(體重約 200g)，購買于上海斯萊克實驗動物中心。所有動物飼養在恒定的溫度[(22±2)℃], 自由進食、進水。本實驗所有動物均獲得倫理學批準。

1.2 動物分組及模型制備 將30只大鼠按照隨機數字表法平均分入假手術組、模型組和治療組。假手術組：僅游離左精索靜脈而不進行縮窄和結扎。模型組：根據Turner法使左腎靜脈部分狹窄。8周后再次進入大鼠腹腔，在麻醉后顯微鏡下測量左精索靜脈直徑擴張>1mm作為納入精索靜脈曲張大鼠模型組的標準。治療組：在模型組建立成功的基礎上，術后8周在顯微鏡下游離并結扎左精索靜脈，術后繼續飼養4周。

1.3 標本采集 8周時假手術組和模型組大鼠取下左側睪丸，切分兩部分，一部分凍存-80℃冰箱備用，一部分浸泡于福爾馬林。治療組大鼠在靜脈結扎術后再飼養4周后進行與模型組和假手術組相同的操作留取凍存標本備用。通過HE染色觀察睪丸的病理情況和免疫組化檢測TXNDC5蛋白。

1.4 HE染色 通過4%多聚甲醛將三組大鼠睪丸組織固定24h后，常規石蠟包埋。將睪丸組織標本切成5μm厚的切片，再經過脫蠟, 水合，蘇木精—依紅染色后封片。采用光學顯微鏡(NIKON公司)進行圖像采集。

1.5 免疫組化 將4%多聚甲醛固定且石蠟包埋后的三組睪丸組織標本切成5μm厚的切片，再通過脫蠟，水合，在3%H2O2中高壓修復15min。切片用PBS 沖洗3次，在玻片的組織部位滴加TXNDC5一抗(proteintech，1∶100)置于濕盒中室溫孵育2h。再次用PBS 沖洗3次，再滴加HRP標記光譜二抗，孵育30min。DAB染色后蘇木精復染。再使用二甲苯反復兩次沖洗染色好的玻片，中性樹膠封片后，采用光學顯微鏡(NIKON公司)進行圖像采集。顯微鏡下棕褐色為陽性染色。染色越深，反映細胞內蛋白表達量越高。

2 結果

2.1 各組大鼠睪丸組織形態觀察 根據HE染色可以觀察到，假手術組大鼠睪丸組織各曲細精管內生精細胞形態規則，層次清楚，結構正常。模型組大鼠睪丸組織病理損傷明顯，各級生精小管排列錯亂，生精細胞和精子細胞明顯減少。治療組大鼠睪丸組織病理損傷較輕，曲細精管層次輕度錯亂，少量曲細精管內生精細胞減少。見圖1。

圖1 光鏡下各實驗組大鼠睪丸組織顯微結構(HE×200)a.假手術組：睪丸生精細胞排列致密且完整 b.模型組：睪丸生精細胞排列錯亂且數量減少 c.治療組：睪丸生精細胞排列正常或輕度錯亂

2.2 VC下調TXNDC5的表達 根據免疫組化實驗(見圖2)可見假手術組大鼠睪丸細胞染色最深，而模型組大鼠睪丸細胞染色最淺。由此說明假手術組大鼠睪丸組織內TXNDC5蛋白水平較模型組大鼠較高，但通過治療大鼠睪丸組織內TXNDC5蛋白水平有一定的升高。即精索靜脈曲張可導致大鼠睪丸內TXNDC5蛋白水平降低，但通過精索靜脈高位結扎術可以上調一定的TXNDC5蛋白水平。

圖2 免疫組化檢測各實驗組大鼠睪丸組織中TXNDC5的表達(HE×200)a.假手術組 b.模型組 c.治療組

3 討論

精索靜脈曲張是引起我國男性不育最常見的疾病之一，其發生機制眾多且未完全闡明[8]。其中氧化應激學說是指機體在受到損傷時處于氧化應激狀態，過量產生的ROS會導致機體二次損傷。生理濃度的ROS有利于精子的生長發育，但精索靜脈曲張時產生過多的ROS會導致抗氧化酶的平衡失調從而損傷精子[9-10]。過量的ROS會導致精子功能的損害。同時，受損傷的精子更容易受到ROS的攻擊，從而導致惡性循環，使得精子損傷進一步加重[11]。本文構建大鼠VC動物模型，并研究精索靜脈曲張高位結扎術對其治療效果，結果顯示與假手術組相比較，模型組大鼠睪丸組織受到明顯病理損傷，睪丸組織形態排列錯亂、生精細胞和精子細胞明顯減少。而通過精索靜脈高位結扎術后，可以一定程度扭轉精索靜脈曲張引起的病理損傷。由此說明VC大鼠存在一定程度的氧化應激損傷，而這種損傷存在一定的可逆性。

TXNDC5基因作為上皮PDI基因家族成員之一。其表達的TXNDC5蛋白在抗氧化作用中起到了重要的作用。在缺氧環境下過量產生的ROS會導致HIF-1α的表達增加，HIF-1α作為細胞缺氧的分子標志，可以保護細胞質免受蛋白酶體的降解，從而負反饋來抑制ROS的進程[11]。TXNDC5蛋白可以與HIF-1α結合并保持其穩定性從而起到抗氧化作用[12]。另外，通過對類風濕關節炎病人蛋白質樣本的質譜分析，確定了TXNDC5在內源性抗氧化反應中有調節作用[13]。TXNDC5也被證實與ERpl8在細胞中共同調節氧化還原酶的活性，是氧化還原狀態，Ca2+泵等的關鍵調節蛋白[13-14]。本實驗結果顯示，模型組TXNDC5蛋白水平較假手術組相比明顯下調。說明TXNDC5蛋白水平表達失調可能是導致VC發生發展的一條病理通路。

本實驗結果顯示VC模型大鼠睪丸組織內可見明顯的病理損傷。說明VC可產生超出機體承受范圍的ROS，從而一定程度地損傷睪丸組織及其生精細胞。同時這些損傷可通過精索靜脈高位結扎得到一定程度的扭轉。另外，本實驗結果亦顯示VC模型大鼠TXNDC5蛋白水平下調，因此推測VC氧化應激是通過下調TXNDC5蛋白，從而使得大鼠睪丸組織抗氧化能力降低，從而受到一定程度的氧化應激損傷。即VC中ROS可以抑制TXNDC5蛋白表達，從而導致睪丸組織的損傷。但VC發生機制眾多，本文通過研究TXNDC5表達誘導精索靜脈曲張睪丸組織氧化應激損傷的分子機制，希望能為闡明VC發生機制以及評估VC手術指征與術后療效提供一個新思路。