花青素定性定量分析方法及其應(yīng)用的研究進(jìn)展

杜黎明，欒志慧，葛加榮，沙悅

花青素是通過苯丙烷途徑產(chǎn)生的一種天然水溶性類黃酮色素，在花卉、蔬菜和水果中呈現(xiàn)出各種顏色.花青素顏色易受pH、光、植物激素、轉(zhuǎn)錄因子、溫度和金屬離子的影響.現(xiàn)有文獻(xiàn)中報道了約700 種花青素化合物，它們具有潛在的健康益處，也是天然著色劑的來源［1］.富含花青素的植物包括葡萄、藍(lán)莓、蘿卜、草莓、桃子、梨和李子等.許多體外和體內(nèi)研究表明，花青素是具有多種健康益處的潛在抗氧化劑，如抗癌、抗糖尿病、抗高血壓和抗肥胖［2］.這些化合物還與預(yù)防心血管疾病，改善視覺和神經(jīng)健康益處有關(guān).此外，還證明花青素可以增加與組織再生密切相關(guān)的成纖維細(xì)胞增殖的代謝活性［3］.由于花青素抗氧化活性、顏色和其他物理性質(zhì)，其在化妝品行業(yè)、食品著色行業(yè)中的應(yīng)用也更加廣泛.富含花青素的花朵與果實也越來越多地被用于農(nóng)業(yè)食品行業(yè)，作為多種美食菜肴的佐餐或作為飲食的一部分.

已有研究成果盡管已經(jīng)廣泛證實了花青素的益處和特性，但很少涉及使用創(chuàng)新的提取和分析技術(shù)來研究植物中的花青素，提取后花青素的穩(wěn)定性和保持與基質(zhì)結(jié)合的強(qiáng)烈趨勢仍然是需要解決的主要問題.目前，有大量文章關(guān)于對花青素提取、純化、分離與鑒定方法的優(yōu)化.本文旨在討論各種方法在花青素定性定量分析中的應(yīng)用，并強(qiáng)調(diào)這些技術(shù)對花青素分析的重要性，為今后花青素創(chuàng)新提取方法和分析技術(shù)奠定基礎(chǔ).

1 花青素的生物合成

花青素的生物合成途徑在擬南芥、煙草等模式植物或各種作物中都有很好的表征，并且大致是高度保守的.這種途徑是苯丙素途徑的一個重要分支，從苯丙氨酸開始（圖1）并最終生成不同種類花青素.苯丙氨酸被苯丙氨酸解氨酶（PAL）轉(zhuǎn)化為肉桂酸.肉桂酸在肉桂酸?4?羥化酶（C4H）的作用下轉(zhuǎn)化為p?香豆酸，隨后通過4?香豆CoA 連接酶（4CL）轉(zhuǎn)化為4?香豆酰CoA.在查爾酮合成酶（CHS）的作用下，將一個4?香豆酰CoA（I）分子與三個丙二酰CoA（II）分子縮合，生成四羥基查爾酮（III）.四羥基查爾酮通過查爾酮異構(gòu)酶（CHI）的作用異構(gòu)化產(chǎn)生三羥黃烷酮（IV），也稱柚皮素.柚皮素通過黃烷酮?3?羥化酶（F3H）在C 環(huán)上羥基化，通過黃烷醇?3'羥化酶（F3'H）或黃烷酮?3'5'羥化酶（F3'5'H）在B 環(huán)上羥基化成各種黃酮類化合物的中心支點，生成二氫山奈酚（VII）、二氫槲皮素（VIII）和二氫楊梅素（IX）.F3'H 和F3'5'H 對柚皮素的B 環(huán)羥基化分別產(chǎn)生依諾二烯醇（V）和五羥基黃烷酮（VI）.花青素生物合成的下一步是二氫黃酮醇4?還原酶（DFR）作用于三種雙氫黃酮醇中的一種，即二氫山奈酚（VII）、二氫槲皮素（VIII）或二氫楊梅素（IX），以產(chǎn)生相應(yīng)的無色花青素，即無色矢車菊素（X）、無色天竺葵素（XI）和無色飛燕草素（XII）.再通過白花青苷加氧酶/花青素合酶（LDOX/ANS）的作用轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的花青素（紅色天竺葵素（XIII）、紫色矢車菊素（XIV）和藍(lán)色飛燕草素（XV））.花青素生物合成的最后一步是O?糖基化（圖2）.與保守的主要類黃酮途徑相反，通過糖基化對花青素的修飾是多樣的，具有家族和物種依賴性.驅(qū)動這些修飾的酶特定于修飾的位置和供體底物.細(xì)胞質(zhì)中的糖基轉(zhuǎn)移酶促進(jìn)糖基化.在ANS 穩(wěn)定花青素作用后，糖基化立即發(fā)生.最常研究的糖基化為UDP?3?O?葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT/3GT）添加葡萄糖基［4］.

圖1 花青素合成途徑

圖2 花青素糖基化過程

花青素的合成受調(diào)控基因控制.在轉(zhuǎn)錄水平上，花青素生物合成基因的表達(dá)受R2R3?MYB 轉(zhuǎn)錄因子以及由R2R4?MYB、bHLH 和WD40 因子形成的三元復(fù)合物（稱為MBW 復(fù)合物）［5］的調(diào) 節(jié).MYB75 是屬于R2R3?MYB 家族的轉(zhuǎn)錄因子，在多種植物中被證實有調(diào)控花青素合成的作用.例如，過度表達(dá)MYB75 基因的擬南芥植物在根、莖、葉和花中顯示出更多的花青素積累，而相反，MYB75 突變體顯示出這些分子的較低積累［6］.MYB75 在調(diào)節(jié)花青素積累方面的重要性似乎也在一些作物中得到證實，如獼猴桃［6］、番茄［7］、丹參［8］、蕪菁［9］等.目前研究得出WD40 重復(fù)基因OsTTG1 調(diào)控水稻花青素生物合成［10］，對其研究大多存在于生菜、甘藍(lán)、小麥、油菜等作物中.

不同的基因在不同的組織中以不同的水平表達(dá)，作為發(fā)育階段和環(huán)境條件的函數(shù).特定組織中的基因組通過影響受體的目標(biāo)基因凸顯其特異性，從而影響特定花青素生物合成基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)該組織中類黃酮的差異積累.因此，花青素在植物組織中的正確分布需要類黃酮生物合成途徑的準(zhǔn)確時空調(diào)控，并反映轉(zhuǎn)錄因子的組織特異性組合.

2 花青素的定性定量分析

2.1 花青素的提取

從自然界分離的花青素高度不穩(wěn)定且易于降解，這導(dǎo)致生物活性喪失和褪色.影響降解速率的因素包括光照、溫度、pH、氧氣、酶、和濕度等.基于花青素復(fù)雜性和對具有特定化學(xué)特征的特定分子的選擇性搜索，從生物基質(zhì)中提取花青素有不同的策略［11］.例如，花青素的提取通常通過使用水性/有機(jī)混合物進(jìn)行，其中有機(jī)部分的貢獻(xiàn)很大.相反，花青素通常用更親水的溶劑或更顯著的水基混合物提取.在所有情況下，保持黃烷形式的化合物的電離狀態(tài)是非常有用的，可以通過向水相中添加無機(jī)或有機(jī)酸來實現(xiàn)這一目標(biāo).植物、食品和農(nóng)業(yè)樣品通常用乙醇/甲醇∶水混合物（70?95∶30?5）萃取，用鹽酸、甲酸或其他有機(jī)酸（如檸檬酸）酸化［12］.當(dāng)基質(zhì)耐酸性均質(zhì)化時，例如在植物種子的情況下，選擇在超聲波和溫度的幫助下使用最強(qiáng)和更親脂性的有機(jī)溶劑［13］.相反，液體基質(zhì)（即紅酒、果渣和果汁）用酸性酒精溶液處理［14?16］.

提取溫度和pH 也影響花青素的回收.在水提取之前加熱植物材料，不僅使多酚氧化酶的水解活性失活，而且有助于破壞植物細(xì)胞，提高花青素提取的產(chǎn)量，不同的植物材料根據(jù)體系的可萃取性，以及基質(zhì)中總花青素的數(shù)量，萃取過程會重復(fù)幾輪，每部分最適溫度及pH 等均不同.NICOUé 等人比較了溫度、溶劑和萃取溶劑的pH 對野生藍(lán)莓花青素回收的影響.在乙醇和磷酸（pH 值4.6；0.02%v/v）中提取的總花色苷和單體花色苷的產(chǎn)率最高［17］.國內(nèi)研究也在尋找各個物種花青素提取的最適溫度，發(fā)現(xiàn)酸法提取紫茄皮花青素的最優(yōu)提取方案提取溫度為60 ℃［18］、洛神花花青素最佳提取工藝條件溫度為30 ℃［19］、藍(lán)莓酒渣花青素提取的最佳提取溫度為50 ℃［20］.

然而，使用這些溶劑會產(chǎn)生一系列劇毒廢物，需要在處置前進(jìn)行處理［21］.因此，人們越來越擔(dān)心傳統(tǒng)溶劑的環(huán)境影響和有害健康影響，這增加了提取過程和成品過程中工人安全的法律要求［22］.在過去的幾十年中，人們不斷開發(fā)新的生態(tài)提取替代品.最近，一種被稱為天然深共晶溶劑（NADES）的新型綠色提取技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)，以滿足生物降解性、可持續(xù)性、低毒性、低成本和易于處理的要求.使用天然深共晶溶劑（NADES）提取花青素是一種相對新穎、生物相容和綠色的方法，處于可持續(xù)發(fā)展的前沿，因此近年來激發(fā)了科學(xué)界的興趣［23］.對幾種基于NADES 的花青素提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，其效果與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑相同，但與使用有機(jī)溶劑的提取相比，產(chǎn)率更好.NADES 代表了一種極好的、有用的更新策略，用于藥物和營養(yǎng)品應(yīng)用的基于花青素的產(chǎn)品的綠色提取和生物相容性制備［24］.目前對其應(yīng)用于丹參活性成分的綠色提取及催化轉(zhuǎn)化［25］、提取短瓣金蓮花黃酮類成分［26］、甜葉菊中甜菊糖綠色提取［27］等，具有很高的現(xiàn)實應(yīng)用前景.

2.2 花青素的純化

有效的純化方法確保了化合物的更好表征，從而確保了更可靠的光譜信息.提取的材料含有幾種化合物，如糖、有機(jī)酸、氨基酸和蛋白質(zhì)等，這些化合物可能會損害花青素的穩(wěn)定性.提取后，根據(jù)基質(zhì)（水果、葉子或液體生物樣品），純化程序的第一步是區(qū)分富含綠色和紅色色素的提取物.首先必須去除的強(qiáng)葉綠素成分，其次純化富含花青素的基質(zhì)（水果、花朵或液體生物樣品）.葉綠素消除后，通常根據(jù)目的通過不同的色譜步驟進(jìn)行純化，包括不同的固定相.對于水性提取物，最早期方法是在固相萃取（SPE）樹脂（如C18 濾筒）和Sephadex 基質(zhì)上吸收花青素，以消除更多極性非保留副產(chǎn)物［28］.在更廣泛的吸附純化技術(shù)的進(jìn)展中，還研究了硅膠、Amberlite IRC 80、237 Amberlitte XAD?7HP 和DOWEX 50WX8等對花青素有更高吸附和解吸能力［29］.在某些情況下，高速逆流色譜法（HSCCC）用于從食品中分離花青素的某些成分.HSCCC 的開發(fā)因其低壓、高流速、廣泛的溶劑和更便宜的固定相而廣為人知.其允許在XAD?7 樹脂柱富集粗提取物后分離純化合物.觀察到由正丁醇/乙酸乙酯/0.5%乙酸（3∶1∶4）和0.2%三氟乙酸/正丁醇?叔丁基甲醚/乙腈（6∶5∶1）組成的HSCCC 兩相體系是色譜分離的良好混合物，經(jīng)HPLC 和NMR 分析證實［30］.值得一提的是，盡管用不同的溶劑提取方法多種多樣，但這些方法只能用于實驗或表征目的.作為人類食用成分或一般天然色素的提取應(yīng)嚴(yán)格用水進(jìn)行，否則必須仔細(xì)評估溶劑殘留物.

2.3 花青素的分離與鑒定

反相LC（RP?LC）是分離最常用的方法.不同的實驗室通常采用不同的參數(shù)條件來優(yōu)化花青素的分離，因此很難確定單一的標(biāo)準(zhǔn)程序［31］.另一種檢測技術(shù)為UV?Vis，其使用UV 和可見光束通過流動池.它包含一個傳感器，可以在分析物通過柱時檢測光吸收率的變化［32］.UV 不僅提供了糖基化的信息，還提供了糖分子中酰化的程度.UV?Vis 光譜可獲得大量信息，尤其是酰化花青素，在UV?Vis光譜中提供典型指紋.UV?Vis 光譜法本身可能不夠有效地識別花青素分子.由于兩個或更多的花青素分子可以產(chǎn)生類似的光譜，僅基于UV?Vis 可能會出現(xiàn)錯誤檢測［33］.目前，花青素色譜分析主要基于高效和超高效液相色譜（HPLC 和UHPLC）方法，結(jié)合紫外可見分光光度法和/或質(zhì)譜檢測.HPLC 的正常條件為C18 柱；檢測波長520 mm；乙腈：由磷酸、甲酸或三氟乙酸調(diào)節(jié)pH 值的水溶劑系統(tǒng)［34］.HPLC技術(shù)的敏感性及其簡單性使得這種分析方法在花青素和花青素的定性和定量研究中很受歡迎.常見的5 μm 粒徑HPLC 柱在大多數(shù)分析實驗室中仍然廣泛使用，對花青素和花青素的復(fù)雜混合物仍具有良好的選擇性和分辨率.與HPLC 相比，UHPLC 有更短的分離時間，因此流動相消耗更低［35］.

來自不同串聯(lián)或平行色譜分離（硅膠、陽離子交換和/或反相）的純化合物可以通過核磁共振（NMR）、高分辨率和串聯(lián)質(zhì)譜（HR?MS/MSn）和紅外光譜（FT?IR）進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征.MS/MSn 分析有助于識別特定的斷裂途徑［33］.例如，花青素可以通過質(zhì)譜誘導(dǎo)的MS/MS 裂解后糖部分的損失與它們的苷元（花青素）區(qū)分.相反，苷元對交叉環(huán)裂解敏感，尤其是在環(huán)C上，產(chǎn)生不同的氧鎓片段［34］.在其他花青素研究中，特別是在測定復(fù)雜樣品中的異構(gòu)體時，離子遷移質(zhì)譜（IM?MS）已被證明是一種具有高通量和靈敏度的新型分析方法.IM?MS根據(jù)大小、形狀和電荷分離氣態(tài)離子來工作.通常，LC?MS 用于進(jìn)一步分析并鑒定通過IM?MS 分離的化合物級分.多年來，MS/MS 數(shù)據(jù)庫大大有助于鑒定植物化合物或檢測到的代謝物，特別是當(dāng)使用NMR 342 和X 射線晶體學(xué)無法進(jìn)行完整結(jié)構(gòu)測定時［35］.因此，串聯(lián)質(zhì)譜法（MS/MSn）結(jié)合HPLC 或UHPLC 是一個強(qiáng)大的工具.MS/MSn 可以分析不同的分子轉(zhuǎn)變和碎裂，并將其與文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)和最新的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較.目前，LC?MS 已被證明是鑒定類黃酮苷，特別是花青素的有力分析工具，廣泛應(yīng)用于日常研究中.

以上各項研究中獲得的結(jié)果與方法，代表了對許多與健康促進(jìn)特性或其他用途相關(guān)的有吸引力基質(zhì)的提取技術(shù)的實質(zhì)性改進(jìn)與優(yōu)化.研究人員就植物材料中花青素的最佳提取條件達(dá)成了廣泛一致，這將有助于提取物的化學(xué)成分的一致性，并將其用作潛在的營養(yǎng)物質(zhì)與色素用于體內(nèi)和臨床研究.從這項研究中獲得的結(jié)果是在廣泛領(lǐng)域進(jìn)行進(jìn)一步研究的起點.利用各種技術(shù)在實驗室或工業(yè)水平上提取和分析花青素，以形成富集的復(fù)合物或獲得可用于食品、醫(yī)藥或化妝品行業(yè)的提取物.此外，這些結(jié)果導(dǎo)致對花青素的生物活性與其生物利用度之間的可能關(guān)系進(jìn)行了更深入的研究，以及根據(jù)環(huán)境條件或這些植物所受的外部影響研究不同物種中的花青素含量或花青素的表達(dá).

3 花青素的營養(yǎng)和應(yīng)用

3.1 花青素對人體的保健作用

花青素可食用并能進(jìn)行吸收代謝.在口腔中，花青素主要由口腔微生物群代謝，這些微生物群可以去除糖苷基團(tuán)并將花青素轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的查爾酮.在胃中，花青素被迅速吸收，但最大吸收部位是腸道.花青素在腸道中被吸收，并通過門靜脈到達(dá)肝臟.在這里，它們在腸肝循環(huán)中被代謝、分泌和再吸收，以重新啟動整個途徑［36］.未被吸收的花青素到達(dá)結(jié)腸，在那里它們被結(jié)腸微生物群廣泛修飾，這可能會釋放苷元并產(chǎn)生簡單的酚類物質(zhì)［37］，然后可被結(jié)腸粘膜吸收.然而，花青素可能反過來調(diào)節(jié)結(jié)腸微生物群組成.花青素的攝入會導(dǎo)致雙歧桿菌、乳桿菌或放線桿菌等有益細(xì)菌的增加［38］.眾所周知，益生菌可能對人體健康產(chǎn)生多種有益影響，因此，攝入花青素后觀察到的積極影響可能部分是由于腸道微生物群的調(diào)節(jié).

花青素具有抗氧化功效.花青素的抗氧化功效由其結(jié)構(gòu)控制.研究表明茄子和蘿卜中提取的花青素對氧自由基吸收能力的三維定量結(jié)構(gòu)?活性關(guān)系（3D?QSAR）［39］.羥基對花青素B 環(huán)、甲氧基化和3 位糖基單元數(shù)量的影響有關(guān).B 環(huán)中的羥基被甲氧基取代降低了抗氧化能力［40］.花青素抗炎、抗癌、抗高血壓和抗腫瘤活性的研究可能是花青素研究的下一個很好的探索領(lǐng)域.目前研究人員重點關(guān)注心血管和神經(jīng)退行性疾病［37］和Ⅱ型糖尿病［39］的影響并對其開展研究.此外，花青素可以增加與組織再生密切相關(guān)的成纖維細(xì)胞增殖的代謝活性，這就是花青素被用于治療不同疾病的原因.

3.2 花青素對食品的著色作用

食品工業(yè)使用許多化學(xué)物質(zhì)作為食品著色劑.然而，這種使用帶來了許多問題，主要是健康風(fēng)險，人工合成染料被懷疑會造成不良的行為影響.花青素具有安全性和潛在的健康保護(hù)作用，是合成物質(zhì)的一種有吸引力的替代品.在歐洲、日本、美國和其他國家廣泛允許將花青素用作食品和飲料中的食品著色劑［40］.可以從花青素添加中受益的產(chǎn)品包括軟飲料、面包、果醬、果凍、糖果或乳制品等.除了為食物提供顏色，花青素還可以提供額外的抗氧化保護(hù)作用.同時也可以為食物提供獨特的品質(zhì)，因為它們可以增加營養(yǎng)潛力，對消費者產(chǎn)生健康促進(jìn)作用.然而，使用花青素作為天然食品著色劑存在幾個問題.首先，花青素的穩(wěn)定性不是最佳的，因為它們往往會快速降解，主要原因是光、氧、酶、金屬、其他氧化劑的存在、pH 和溫度［41］.其次，與合成著色劑相比，花青素價格相當(dāng)昂貴.作為潛在食品著色劑的花青素來源有葡萄皮、藍(lán)莓、蘿卜、紅薯、紅甘藍(lán)、桑葚、黑胡蘿卜、紅豆、西梅、木槿等［42］.一般來說，酰化花青素是首選的食品著色劑，因為它們比非酰化花青素更穩(wěn)定.一些水果、蔬菜或喬木可以低成本提取大量的非酰化花青素，因此，非酰化花青素在食品工業(yè)中也有潛在的用途［43］.花青素作為食品著色劑由于自然、有機(jī)和可持續(xù)食品市場的動態(tài)增長，對非合成食品著色劑的需求繼續(xù)增加，花青素在過去三十年中填補(bǔ)了這一空白［44］.

4 結(jié)論

花青素及其家族中無數(shù)成員產(chǎn)生的途徑是天然氧化劑及色素生物遺傳學(xué)中最常見的研究領(lǐng)域之一.這一焦點（檢測分子、其穩(wěn)定性以及在各種提取與鑒定）是由與這些分子相關(guān)的需求驅(qū)動的.花青素具有抗氧化、抗炎和抗癌活性.他們緩解癌癥、糖尿病和其他代謝紊亂引起的并發(fā)癥的能力已經(jīng)在研究及臨床得到驗證.然而，對其定性定量分析及應(yīng)用應(yīng)開展更多的研究，以保證其質(zhì)量及對人體的作用效益.目前花青素含量更高的產(chǎn)品從研究中推向市場，分析和穩(wěn)定性相關(guān)的問題是該行業(yè)目前面臨的兩個問題.自然界中分離的花青素極不穩(wěn)定，易降解，導(dǎo)致生物活性喪失和變色.因此，如何在保證其穩(wěn)定的同時加以分析是目前的研究重難點，對于不同植物不同組織的提取分析方法也有所不同，應(yīng)該總結(jié)并優(yōu)化前文所示方式方法，構(gòu)建成熟的系統(tǒng)利用現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行分析，使天然花青素更多進(jìn)入日常的生產(chǎn)生活，產(chǎn)生更多的經(jīng)濟(jì)利益和營養(yǎng)健康價值.

花青素在改善各種疾病方面的作用一直是人與自然相互作用的組成部分.然而，對花青素導(dǎo)致這些效應(yīng)的機(jī)制和作用方式的更深入理解尚未闡明.目前的研究僅限于分子水平，但隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，研究者可以加強(qiáng)綜合基因組學(xué)、表型基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究，并使用多種手段探索植物中花青素調(diào)控機(jī)制和代謝途徑的未知部分，然后揭示花青素與顏色、含量及穩(wěn)定性的關(guān)系.總的來說，隨著研究的深入，將對花青素定性定量分析的方法及機(jī)制有更清晰的了解，從而建立一個穩(wěn)定的系統(tǒng)，利用生物學(xué)技術(shù)提取及鑒定花青素，這將為未來的花青素生信分析提供堅實的技術(shù)和信息基礎(chǔ).