同源異形盒基因A1在結腸癌組織中的表達及臨床意義

姜韜，馬麗園，邢林帥，趙立鵬，葉子琪，馬碩，師新榮 .寧夏醫科大學總醫院結直腸外科，寧夏 銀川 750004；.寧夏醫科大學總醫院超聲科，寧夏 銀川 750004；.寧夏醫科大學研究生院，寧夏 銀川 750004

世界范圍內，結腸癌是發病率排序第三的惡性腫瘤，復發和轉移是導致根治術后生存率降低的主要因素，鑒定新型治療靶標對結腸癌個體化治療及預后具有重要意義[1-3]。同源異形盒基因A1 (homeobox A1，HOXA1)屬于HOX 轉錄因子家族，位于人染色體7p15.2基因編碼區，是細胞分化、DNA修復、細胞凋亡等生物學行為的關鍵調節基因，其表達異常會引起個體發育和組織器官形成過程中出現異常形態結構，與肺癌、黑色素瘤、胰腺癌等惡性腫瘤的發生發展密切相關[4-5]。目前HOXA1 與結腸癌的關系尚未見報道。本研究旨在明確HOXA1 在結腸癌組織中的表達情況，探討其在結腸癌發生發展中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般材料 (1)結腸癌新鮮冰凍組織：隨機選取2021 年3～10月寧夏醫科大學總醫院結直腸外科手術切除結腸癌樣本66 例，其中右半結腸41 例，左半結腸25例。同時取距癌灶邊緣最遠處(至少＞5 cm)正常結腸組織作為對照。取材后將標本凍存管立即置于液氮中，登記信息并最終保存于-86℃低溫冰箱中。所有樣本病理最終確診為結腸腺癌，術前均未行新輔助化療。66例患者中Ⅰ期2例，Ⅱ期27例，Ⅲ期34例，Ⅳ期3例。(2)結腸癌石蠟組織芯片(tissue microarray，TMA)：由課題組構建完成，所有結腸癌組織及配對正常結腸組織均取自于寧夏醫科大學總醫院結直腸外科手術病例標本庫，一套組織芯片共13 張，由203 例結腸癌+結腸正常組織構成。其中男性110 例，女性93 例；年齡21～88 歲，中位平均63.5 歲；AJCC 分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期81例，Ⅲ期80例，Ⅳ期18例(均存在遠處臟器轉移)。組織學分型：高分化腺癌100 例，中分化腺癌35 例，低分化腺癌68 例。所有病例資料TNM分期參照結直腸癌(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南[6]。本研究獲得寧夏醫科大學總醫院倫理學會批準，患者及家屬對本研究知情并簽署相關知情同意文件。

1.2 試劑與方法

1.2.1 試劑 RT-qPCR 引物由上海生工公司合成，RNeasy protect Mini kit(Qiagen，德國)，反轉錄RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific，美國)，PCR 試劑盒SYBR Green qPCR Master Mixes (Thermo Scientific，美國)，Anti-HOXA1 抗體(ab230513，Abcam)，免疫組化EnVisionTMDetection Kit (Dako，丹麥)，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(Beyotime，中國)。

1.2.2 方法 (1)RT-qPCR：組織RNA提取參照試劑盒說明，紫外分光光度計檢測260 nm和280 nm處的吸光度值，檢測RNA的純度。通過反轉錄反應以Oligo(dT)15為引物，由Total RNA的3’Poly(A)區域引導出cDNA，以cDNA 產物為模板，設計合成PCR 引物：HOXA1 Forward primer：5'-CGGCTTCCTGTGCTAAGTCT-3'，Reverse primer：5'-TTCATTGTGCCATCCATCAC-3'。β-actin Forward primer：5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'，Reverse primer：5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'。采用SYBR Green 熒光染料在Eppendoff 高通量熒光定量PCR 儀中進行。每份標本設3 個平行對照反應孔，反應條件：50℃2 min，95℃10 min，95℃20 s，60℃30 s，70℃30 s，共40 個循環，反應結束后自動分析熒光信號并轉換為起始拷貝數及循環閾值(Ct)。以2-△△Ct值為mRNA 相對表達量。(2)免疫組織化學：將結腸癌組織芯片(4 μm)分別于二甲苯中脫蠟，梯度乙醇中水化。檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中行高壓抗原熱修復，3%H2O2封閉內源性過氧化物酶10 min。PBS洗5 min×3 次后，滴加用一抗：(Anti-HOXA1 antibody，1∶200)50 μL，4℃孵育過夜。室溫復溫后滴加EnVision?Detection Kit，Peroxidase/DAB，Rabbit/Mouse(鼠/兔通用型)二抗200 μL，室溫孵育30 min。顯微鏡下DAB(二氨基聯苯胺)顯色，蘇木素復染、鹽酸乙醇化、脫水并中性樹膠封片。用已知結腸癌切片作為陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照。結果判讀：細胞內出現棕黃色顆粒者為陽性。根據染色的范圍和強度之和進行評分：染色范圍：0分，0%；1分，1%～25%；2分，26%～50%；3分，＞50%。染色強度：0分，未染色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。最終結果：0～2分，陰性；3～4分，弱陽性；5～6分，強陽性[7]。

1.3 統計學方法 應用SPSS25.0 統計軟件分析所有數據。計量資料以均數±標準差()表示，計數資料比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 RNA 質量控制 所有樣本的RNA 在A260/A280的比值均在1.8～2.0，結果顯示所提取的RNA無蛋白質污染，無降解，可用于RT-qPCR檢測。

2.2 66 對結腸癌新鮮冰凍樣本HOXA1 mRNA的表達水平 RT-qPCR檢測結果顯示，結腸癌組織中HOXA1 mRNA 的相對表達量為5.634±0.563，明顯高于正常結腸組織的1.893±0.442，差異具有顯著統計學意義(P＜0.01)，見圖1。

圖1 RT-qPCR檢測66對樣本HOXA1 mRNA的表達水平Figure 1 RT-qPCR analysis of HOXA1 mRNA expression in 66 paired specimens of colon cancer tissues and normal tissues

2.3 結腸癌及配對正常組織中HOXA1蛋白的表達水平比較 203例結腸癌組織芯片進行免疫組織化學檢測，結果顯示，HOXA1 蛋白主要表達于細胞核中，其在結腸癌組織中的表達陽性率高于正常結腸組織，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)，見表1和圖2。

圖2 結腸癌及配對正常組織中HOXA1蛋白的表達水平(DAB染色×10)Figure 2 Expression of HOXA1 protein in colon cancer tissue and corresponding normal tissues(DAB staining×10)

表1 結腸癌及配對正常組織中HOXA1蛋白的表達水平比較[例(%)]Table 1 Comparison of HOXA1 expression level in human colon cancer tissue and corresponding normal tissue[n(%)]

2.4 HOXA1 表達與結腸癌臨床病理特征的關系 結腸癌組織中，HOXA1 的表達水平與患者年齡、性別及腫瘤位置無顯著相關性(P＞0.05)；HOXA1 表達水平與AJCC 分期、腫瘤浸潤深度(T 分期)、淋巴結轉移、遠處轉移及組織學分型相關(P＜0.05)，見表2。HOXA1 表達越強，患者AJCC 分期越晚，具備組織學分型差的高危因素。

表2 203例結腸癌中HOXA1表達與臨床病理特征的關系(例)Table 2 The relationship between HOXA1 expression and clinicopathological characteristics in 203 cases of colon cancer(n)

3 討論

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發生發展是由遺傳物質改變和外部環境相互綜合作用長期演變的結果。目前針對結腸癌的發生發展機制尚未完全闡明，但與之相關的新型分子生物標志物篩選為其提供了新的治療方向[8]。同源異形盒基因A1(HOXA1)作為轉錄調控基因參與了腫瘤細胞惡性生物學行為相關基因的轉錄調控。血管新生是惡性腫瘤重要的生物學特征，HOX基因家族成員在血管新生中具備正向調控及反向調控的作用。例如：HOXA3 可通過上調ICAM1、MMP14 等基因的表達促進血管新生，而HOXA5、HOXB13 則通過下調VEGFR2、HIF1α、ephrin A1等血管生成基因的表達發揮抑制血管新生的作用[9]。文獻報道HOXA1的異常高表達可以促進肺癌、黑色素瘤、胰腺癌等惡性腫瘤的發生發展[10-11]。HOXA1 廣泛存在于乳腺上皮細胞，其異常高表達能夠促進乳腺上皮細胞間質轉化，進而調控Wnt/β-catenin信號通路促進乳腺癌的發生發展[12-14]。在乳腺癌中，RBCK1/HOIL-1 以及TRAF2 是HOXA1 的下游特異性靶點。HOXA1通過與TRAF2啟動子序列結合直接激活TRAF2，進而活化IκB激酶(IKK)并磷酸化降解IκBα，激活NF-κB信號通路，最終導致腫瘤細胞增殖活性增加、凋亡減少等惡性生物學行為改變[15-16]。

本研究應用結腸癌新鮮冰凍樣本檢測HOXA1 mRNA 的表達情況，結果顯示HOXA1 在結腸癌組織中的mRNA表達水平顯著高于正常結腸組織。203例結腸癌石蠟樣本中進一步免疫組化結果顯示，62.56%的結腸癌組織中高表達HOXA1，顯著高于對照組，此結果與轉錄水平檢測結果一致。結腸癌中HOXA1的高表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移及組織學分型相關，而與年齡，性別及腫瘤位置無顯著相關。HOXA1 高表達的患者淋巴結轉移率為85.71%，而陰性表達的患者淋巴結轉移率僅為14.28%。HOXA1 在Ⅲ～Ⅳ期結腸癌患者中的高表達比例顯著高于Ⅰ～Ⅱ期結腸癌的患者(82.65%vs 43.81%)。上述結果提示高表達HOXA1的結腸癌患者具備預后不良的高危因素。

綜上所述，HOXA1 異常高表達在結腸癌進展過程中起到重要的作用，HOXA1 異常高表達的結腸癌患者淋巴結轉移率高，臨床分期晚，提示此類患者預后不良，HOXA1 可能為判斷結腸癌預后的新型分子標志物。但是HOXA1促進結腸癌發生發展的分子生物學機制尚未明確，需要進一步研究探討。