熱打擊對人臍靜脈內皮細胞黏附分子表達的影響

何旋，陳文達，潘志國

解放軍南部戰區總醫院重癥醫學科/解放軍熱區損傷與組織修復重點實驗室，廣東 廣州 510010

重癥中暑是機體暴露于高環境溫度或劇烈運動后，機體核心體溫超過40℃以中樞神經系統損害為主要特征的急性熱損傷相關疾病，常可伴隨全身炎癥反應綜合征，患者病情進一步加重將繼發多臟器功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)甚至危及患者生命[1-2]。目前大量研究表明，在重癥中暑的病理生理過程中，涉及內皮細胞、腸上皮細胞的損傷以及凝血系統的失衡[3]；大量炎癥因子的釋放通過炎凝通路互相作用進而引發MODS，其中血管內皮細胞(vascular endothelial cells，VECs)是中暑發病過程中損傷最早的細胞，其損傷被認為是重癥中暑病理生理進展的關鍵環節[4-5]。但目前重癥中暑導致VECs損傷并繼發炎癥反應的具體機制仍不明確。P-選擇素、E-選擇素及細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)均屬于細胞黏附因子選擇素家族，當血管內皮細胞受到各種理化因素刺激時，上述黏附因子選擇素家族表達量增加[6]，從而介導白細胞和血小板的黏附和聚集，進而誘導機體產生一系列炎癥反應過程，加重病情發展。本研究旨在觀察熱打擊對人臍靜脈內皮細胞內(HUVEC)重要黏附因子P-選擇素、E-選擇素及ICAM-1 表達的影響，以探討熱打擊后血管內皮細胞參與的部分機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料與試劑 P-selectin 購買自SANTA CRUZ，貨號sc-6943)；E-selectin 及ICAM-1均購買自Abcam，貨號分別為ab185698 及ab53013)；Anti-mouse IgG HRP-linked Antibody、Anti-rabbit IgG HRP-linked Antibody 及GAPDH 均購買于北京瑞康生物。

1.2 細胞培養 人臍靜脈內皮細胞株(HUVEC)為南方醫科大學病理生理學實驗室贈送。HUVEC細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM 培養液中。將HUVEC 細胞置于細胞培養箱中培養，次日根據細胞生長情況換液。每隔2～3 d進行1次傳代(傳代比例為1∶2～1∶5)。

1.3 細胞分組與熱打擊 對照組將細胞始終置于正常細胞培養箱中培養；熱打擊溫度梯度組分別置于不同溫度梯度(40℃、41℃、42℃、43℃)細胞培養箱打擊2 h，43℃熱打擊不同復溫組于43℃細胞培養箱中打擊2 h，然后置于正常細胞培養箱中培養(按不同復溫時間點復溫0 h、3 h、6 h、12 h)。

1.4 Western blot 檢測P-選擇素、E-選擇素及ICAM-1的表達 按照上述分組處理細胞。用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞3 次，每個6 cm 的培養皿加入50 μL RIPA裂解液在冰上裂解20 min。收集細胞裂解液低溫高速離心(4℃，12 000 r/min，離心15 min)，收集上清于新EP 管。用BCA 蛋白定量/濃度測定試劑盒測蛋白濃度。每個泳道30 μg 蛋白總量進行Western blot 檢測。Western blot 檢測P-選擇素、E-選擇素及ICAM-1的表達。

1.5 免疫熒光觀察HUVEC 細胞P-選擇素及E-選擇素表達 將傳代后的細胞置于激光共聚焦小皿。熱打擊溫度梯度組為分別置于不同溫度梯度(40℃、41℃、42℃、43℃)細胞培養箱打擊2 h，43℃熱打擊不同復溫組于43℃細胞培養箱中打擊2 h，然后置于正常細胞培養箱中培養(按不同復溫時間點復溫0 h、3 h、6 h、12 h)。復溫結束后將皿中培養液移除，PBS 清洗后分別加入4%多聚甲醛固定及使用0.2%Triton X-100 通透，依次加入熒光一抗、二抗及DAPI在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 統計學方法 所有數據均采用Prism 6.0 軟件(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)進行統計學分析。計量資料符合正態分布，以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 溫度梯度熱打擊對HUVEC 細胞P-選擇素表達的影響 分別用溫度為40℃、41℃、42℃及43℃熱打擊HUVEC 細胞2 h，結果顯示，內皮細胞在正常情況下可表達一定量P-選擇素，不同溫度梯度熱打擊HUVEC細胞后P-選擇素的表達水平比較差異無統計學意義(F=0.859 7，P=0.510 1＞0.05)，見圖1。

圖1 不同溫度熱打擊對HUVEC細胞P-選擇素表達的影響Figure 1 Effect of heat stress at different temperatures on the expression of P-selectin in HUVEC cells

2.2 43℃熱打擊后不同復溫時間點HUVEC細胞P-選擇素表達的變化 為了進一步觀察不同復溫時間點HUVEC細胞P-選擇素表達水平的變化，用43℃熱打擊HUVEC細胞2 h，隨后置于37℃孵箱中繼續培養至不同時間點(0 h、3 h、6 h、12 h)。結果顯示，與對照組相比，43℃熱打擊2 h后不同復溫時間點，HUVEC細胞P-選擇素表達水平比較差異無統計學意義(F=0.282 1，P=0.885 0＞0.05)，見圖2、圖3。

圖2 43℃熱打擊2 h后不同復溫時間點HUVEC細胞P-選擇素的表達Figure 2 The expression of P-selectin at different rewarming time points after 2 hours of heat stress at 43℃

圖3 共聚焦檢測43℃熱打擊組不同復溫時間點HUVEC細胞P-選擇素的表達Figure 3 The immunofluorescence of P-selectin at different rewarming time points after 2 hours of heat stress at 43℃

2.3 熱打擊對HUVEC細胞E-選擇素的影響 上述實驗結果表明，無論是不同溫度熱打擊，抑或是43℃熱打擊不同復溫時間點均對HUVEC 細胞P-選擇素表達無影響，為了進一步觀察熱打擊對HUVEC 細胞E-選擇素表達的影響，用43℃熱打擊HUVEC 細胞2 h，隨后置于37℃孵箱中繼續培養至不同時間點(0 h、3 h、6 h、12 h)，結合WB及免疫熒光圖可見，在不受外界刺激情況下，HUVEC僅表達少量E-選擇素，并且主要表達于內皮細胞表面，熱打擊可使HUVEC 細胞表面E-選擇素表達明顯增加，且隨著復溫時間延長而增加，在復溫6 h時達最高，差異有統計學意義(F=20.23，P＜0.05)，見圖4、圖5。而后隨著復溫時間延長而降低，在復溫12 h降至基底水平。

圖4 43℃熱打擊2 h后不同復溫時間點HUVEC細胞E-選擇素的表達Figure 4 The expression of E-selectin at different rewarming time points after 2 hours of heat stress at 43℃

圖5 共聚焦檢測43℃熱打擊不同復溫時間點HUVEC細胞E-選擇素表達的變化Figure 5 The immunofluorescence of E-selectin at different rewarming time points after 2 hours of heat stress at 43℃

2.4 熱打擊對HUVEC 細胞ICAM-1 表達的影響 進一步觀察熱打擊對HUVEC 細胞黏附因子選擇素家族另一成員ICAM-1 表達的影響，用43℃熱打擊HUVEC細胞2 h，隨后置于37℃孵箱中繼續培養至不同時間點(0 h、3 h、6 h、12 h)。結果顯示，熱打擊可使HUVEC 細胞ICAM-1 表達隨復溫時間延長而增加，在復溫6 h 時達最高，同樣至復溫12 h降至正常水平，趨勢與E-選擇素基本一致，差異有統計學意義(F=16.93，P＜0.05)，見圖6。

圖6 43℃熱打擊組不同復溫時間點HUVEC細胞ICAM-1的表達Figure 6 The expression of ICAM-1 at different rewarming time points after 2 hours of heat stress at 43℃

3 討論

重癥中暑是以高熱和中樞神經系統損傷為主要表現的急性熱損傷相關疾病。既往研究認為，重癥中暑病理生理過程中，其重要臟器損害主要來源于熱暴露的直接細胞毒性作用[7-8]。目前越來越多證據表明，重癥中暑引起臟器功能損害的病理生理學過程是一種繼發于熱損傷之后，炎癥和應激作用下機體炎性反應呈“瀑布樣”引發全身炎癥反應綜合征，繼而引起彌漫性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)及MODS9。血管內皮細胞在大量細胞因子作用下可釋放多種細胞因子及黏附分子，進而表現為“類膿毒癥”反應，引發凝血反應產生凝血功能紊亂甚至DIC，凝血反應進一步加劇炎癥反應，產生更多炎癥因子，加重組織細胞損傷和器官功能障礙，并最終導致MODS[10-11]。因此，血管內皮損傷繼發的凝血功能紊亂和MODS被認為是重癥中暑的關鍵性環節[12]。

細胞黏附分子包括經典的免疫球蛋白超家族(ICAM-1、VCAM-1)、選擇素家族(P-、E-、L-選擇素)、整合素分子和非經典如VAP-1 和CD44 等分子，通過介導炎癥細胞與組織或內皮細胞黏附參與炎癥與免疫應答反應，并在出凝血過程、創傷后傷口愈合、腫瘤細胞的浸潤與轉移等多種病理生理過程中發揮著重要的生物學功能[13]。為此，本實驗在體外模擬HUVEC熱應激的過程，觀察熱打擊HUVEC細胞后P-選擇素、E-選擇素及ICAM-1 表達的影響，由此分析重癥中暑發病過程中血管內皮細胞參與的部分機制。

目前大量研究表明P-選擇素在機體內能以膜蛋白和可溶性蛋白分別儲存在血小板和內皮細胞、血液循環中，在血小板及內皮細胞被激活后，P-選擇素在幾分鐘內易位到細胞表面上[14-15]。本研究發現，使用不同溫度梯度熱打擊2 h及43℃熱打擊2 h不同復溫時間點，WB檢測HUVEC細胞P-選擇素的表達水平及免疫熒光觀察HUVEC細胞表面P-選擇素的表達均無明顯差異，該結果與既往文獻中研究結果存在差異，可能與P-選擇素表達方式有關。P-選擇素在正常內皮細胞主要儲存于Weibel-Palade 小體，刺激后快速移位于內皮細胞表面，其最大表達量為刺激后5～10 min，30～60 min內P-選擇素從細胞表面清除。本研究的熱打擊時間為2 h，推測熱打擊早期過程中即有P-選擇素表達改變，而隨打擊時間及復溫時間延長P-選擇素已從細胞表面清除并脫落致細胞上清中，故實驗結果中未能觀察到P-選擇素有表達差異，如有條件可進一步使用酶聯免疫吸附試驗檢測細胞上清中P-選擇素濃度，從而進一步驗證熱打擊對HUVEC細胞P-選擇素表達影響。

E-選擇素在正常內皮細胞基本不表達，在炎癥因子、腫瘤壞死因子TNF-α等的刺激下活化并表達于內皮細胞外膜[16]，介導白細胞滾動并粘附于內皮細胞。有研究發現，在T細胞介導的免疫反應中，T細胞主要通過其表面的黏附分子整合素家族與血管內皮細胞表面選擇素家族經過配體與受體相結合，參與T 細胞發生滾動、停滯進而遷移，通過內皮細胞進入細胞間質，最終到達損傷部位[17]。亦有研究表明，E-選擇素與全身炎癥反應綜合征的嚴重程度存在明顯相關性，并可作為其判斷嚴重程度和預后的相關指標[18]。另外有研究發現，使用中暑小鼠血清刺激血管內皮細胞，VCAM-1 及ICAM-1 的表達顯著上調，對單核細胞的黏附能力增加，表明內皮細胞表面的黏附分子參與了中暑白細胞與內皮細胞的黏附[19-20]。本研究中熱打擊使HUVEC 細胞E-選擇素及ICAM-1 表達明顯增加，在復溫6 h 達峰值，隨后12 h 后降到基底水平，這與既往研究結果相一致[21]：相對于P-選擇素可儲存模式，刺激后E-選擇素的表達需要從頭轉錄。因此，E-選擇素在刺激3～4 h 后細胞表面可檢測到，在16～24 h后下降到基礎水平。

基于上述研究結果，我們推測熱打擊可能主要通過E-選擇素及ICAM-1介導內皮細胞參與炎癥反應，在中暑的“類膿毒癥”反應起到相關重要的作用，而P-選擇素在其中的作用仍不明確，下一步研究中將進一步完善相關檢測方法，從而明確P-選擇素在熱打擊中的表達改變及可能作用機制。本研究將有助于了解重癥中暑內皮損傷及炎癥反應之間的相互關系，為中暑“類膿毒癥反應”提供研究依據。