3株水稻根際促生菌的篩選鑒定及促生作用研究

陳多菲 徐暢 劉文佳 張俐敏 莫繼先

摘要：為發掘具有優秀促生能力的東北地區水稻根際促生菌（PGPR）資源，通過選擇性培養基篩選，對菌株促生特性與能力定量分析，確定目標菌株并進行鑒定，通過盆栽試驗分析其促生效應。在篩選出的5株解磷菌、3株解鉀菌、3株自生固氮菌中，菌株R8具有較強的解磷、合成鐵載體、分泌赤霉素的能力；菌株K25具有較強的解鉀、分泌吲哚乙酸能力；菌株N2具有較強的固氮能力。經鑒定，菌株R8、K25、N2分別為Pantoea eucalypti、Enterobacter sichuanensis、Bacillus zanthoxyli。3株菌株對水稻幼苗均具有顯著的促生作用和定殖于水稻根際的能力。混菌促生試驗發現，T3（K25+N2）、T4（R8+K25+N2）混菌處理組在水稻幼苗的生物量積累、地上部與根系生長、根系形態結構等方面表現出較好的促生效果。混菌組對水稻幼苗的促生作用優于單菌組，具有研發制備微生物肥料的潛力。

關鍵詞：水稻；根際促生菌；鑒定；促生特性；促生作用

中圖分類號：S182? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）24-0196-07

水稻是我國三大主要糧食作物之一，在糧食生產與消費中占據主導地位，全國約有65%以上的國民以稻米作為口糧［1］。2011年以來，我國稻谷產量連續11年穩定在2億t以上，種植面積穩定在 3 000萬hm2 左右，對保障國家糧食安全和促進社會經濟平穩發展發揮了巨大作用［2］。在現代農業生產過程中，化肥和農藥是提高作物產量的重要生產資料［3］。有數據表明，1980年以來我國在水稻種植方面的化肥使用量顯著增加；化肥對農作物產量的提升作用顯著，但增產趨勢在逐漸減弱［4］。在糧食生產過程中，對化肥的過度依賴及過量、盲目、不科學施用，不僅無法達到增產目的，還會降低農作物品質，造成土壤肥力下降，耕地退化，土壤板結、酸化，土壤微生物群落結構惡化以及地下水、農田環境污染等危害，不利于農業的可持續發展。2014年，農業農村部提出“到2020年化肥、農藥使用量零增長行動方案”的“雙減”政策。微生物菌肥因其綠色、安全、高效、環保等特點，受到廣泛的關注與研究［5］。微生物菌肥是近年來發展起來的一種新型肥料，含有大量有益活性微生物，能通過微生物的特定活動為植物提供營養，調節植物生長［6］。微生物菌肥應用于水稻生產，不僅能提高水稻產量，還能提高土壤肥力，提升水稻品質，提高化肥有效利用率，減少環境污染等，有利于綠色農業的發展［7］。

植物根際促生菌（PGPR）是微生物肥料中促進農作物生長發育的關鍵成分，也是其重要的菌種來源［8］。PGPR的應用被廣泛認為是促進綠色農業發展的一種可行策略。PGPR具有直接或間接促進植物生長的能力［9］。通常由PGPR直接轉化養分，如固氮、溶磷、解鉀作用；或通過分泌代謝產物［如胞外多糖、有機酸、1-氨基環丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶、吲哚乙酸、赤霉素、鐵載體等］供植物吸收利用，進而影響植物應激反應［9］；或通過幫助植物抵抗細菌等病原體的侵害以及誘導植物產生系統抗性，間接促進植物生長［8，10］。因此，篩選具有優秀促生潛力的PGPR并開發高效PGPR菌劑，已成為當前國內外研究熱點之一［11］。近年來國內外研究發現，水稻根際促生菌對促進水稻生長發育、提高水稻產量方面具有良好的正向作用。楊華等通過試驗發現，篩選的水稻根際促生菌中，C7-1、20-10、L26、S11-11、GYM-bt5對水稻的種子發芽率、根系、莖的生長以及分蘗方面具有不同程度的提升［12］。戚秀秀等研究發現，在水稻育苗基質中添加解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）LY11，對水稻幼苗地上部生物量、根系活力、氮磷鉀養分吸收的提升效果顯著，并促進秧苗生長，提高其代謝活性［13］。還有研究表明，菌株組合的應用效果優于單一菌株。Sun等通過田間試驗發現，膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）與黑曲霉（Aspergillus niger）聯合施用，對改善土壤微生物數量與結構、土壤酶活性、植物總養分含量及水稻產量有顯著效果，且優于單獨施用［14］。自2000年我國開始微生物菌肥登記以來，登記數量逐年增加，尤其在2015—2018年，登記產品數量快速攀升［15］。但目前適用于東北地區的水稻生長特性、土壤性質的微生物菌肥數量和水稻根際促生菌的相關研究報道較少。本研究從黑龍江省齊齊哈爾市水稻根際土壤中篩選出多株水稻根際促生菌，對其養分轉化能力、植物激素分泌能力進行定量測定，并對優良菌株進行種屬鑒定，對單一菌株與復合菌株在水稻幼苗和根系發揮的促生效應進行探究，旨在為適宜當地水稻施用的微生物肥料開發和應用提供理論基礎與技術支持。

1 材料與方法

水稻根際土壤采樣于黑龍江省齊齊哈爾市的一處稻田（47°21′16″ N，123°55′ 6″ E），種植水稻品種為墾稻19。本試驗采用的水稻品種為綏稻616，水稻育苗基質為市售（氮、磷、鉀含量≥2%，有機物總量≥28%）。

1.1 培養基配方

LB 培養基（1 L）：含酵母浸膏粉5.0 g、NaCl 10.0 g、蛋白胨10.0 g，pH值為7.0。PKO無機磷培養基（1 L）：含葡萄糖10.0 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、（NH4）2SO4 0.5 g、NaCl 0.3 g、Ca3（PO4）2 2.0 g、KCl 0.3 g、MnSO4·H2O 0.03 g、FeSO4·7H2O 0.036 g，pH值為7.0。亞歷山大羅夫培養基（1 L）：含蔗糖 5.0 g、Na2HPO4 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCO3 0.1 g、FeCl3·6H2O 0.005 g、鉀長石粉1.0 g，pH值為7.0。無氮培養基（1 L）：含甘露醇10.0 g、KH2PO4 0.2 g、MgSO4 ·7H2O 0.005 g、NaCl 0. 2 g、CaSO4·2H2O 0.1 g、CaCO3 5.0 g，pH值為7.2。MKB培養基（1 L）：含酪蛋白氨基酸5.0 g、甘油15.0 mL、K2HPO4 2.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g，pH值為7.0。

固體培養基為1 L液體培養基加瓊脂20.0 g。

1.2 試驗方法

1.2.1 PGPR的篩選

將水稻根系上的大塊土壤抖落，無菌水涮下根表附著土壤，離心后取1 g，與 9 mL 無菌水在裝有玻璃珠的錐形瓶中配制成土壤懸液，30 ℃、140 r/min振蕩2 h。梯度稀釋至10-4、10-5、10-6濃度，分別吸取0.1 mL涂布在PKO無機磷培養基平板（解磷菌篩選）、亞歷山大羅夫培養基平板（解鉀菌篩選）。30 ℃培養箱內培養5 d。根據解磷圈、解鉀圈大小，篩選優勢菌株，進行分離純化多代后，保藏備用。采用富集純化法［16］分離高效固氮菌株。取10 g離心后的根際土壤加入90 mL液體無氮培養基中，30 ℃、140 r/min培養5 d，取1%培養物，接種到100 mL液體無氮培養基中進一步培養，之后每2 d轉接1次。重復轉接4次后，梯度稀釋并涂布在固體無氮培養基平板上篩選、純化菌株后，保藏備用。

1.2.2 促生特性能力測定

采用鉬銻抗比色法［17］測定菌株解磷能力；采用火焰原子分光光度計法［18］測定菌株解鉀能力；采用碳氮分析儀測定菌株固氮能力；采用濃硫酸反應法［19］測定菌株分泌赤霉素能力；采用Salkowski比色液比色法［20］測定菌株分泌吲哚乙酸能力；采用CAS檢測液檢測法［21］測定菌株鐵載體合成能力。每組均設3次重復。

1.2.3 菌種鑒定

菌株形態學鑒定與生理生化試驗方法參考《常見細菌系統鑒定手冊》［22］進行操作。16S rDNA測序工作由上海生工生物工程公司進行，采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增。將測序結果于EzBioCloud數據庫中進行同源性比對，使用MEGA 7.0軟件及Neighbor-Joining法構建菌株系統進化樹。將測得序列批量上傳至GenBank獲得菌株登錄號。

1.2.4 菌株生長曲線測定

將保藏的菌株分別接種于50 mL的LB液體培養基，30 ℃、140 r/min振蕩培養16 h活化后，轉接至100 mL的LB液體培養基中，同條件下培養24 h，每隔2 h測定吸光度（D600 nm），繪制各株菌生長曲線。

1.2.5 浸種促生試驗

用3.5%次氯酸鈉溶液將水稻種子消毒5 min，再用75%乙醇消毒5 min，無菌水洗凈。分別用無菌水、3種供試菌株菌懸液（D600 nm=0.5）浸種24 h。將水稻種子轉至無菌且鋪有雙層濾紙的培養皿中，每皿放20粒種子，每組設3次重復。在30 ℃、濕度60%的氣候箱中培養，7 d后測量水稻種子胚根長、芽長、苗鮮質量及苗干質量［23］。

1.2.6 定殖試驗

將水稻種子消毒（方法同“1.2.5”節）后，28 ℃浸泡2 d，每12 h換水1次。用紗布包裹種子，28 ℃催芽24 h，中間用無菌水沖洗1次。挑取萌發程度相近的種子，無菌操作轉移至已滅菌裝有石英砂、20 mL 1/4MS營養液的大試管中，每管轉入3株幼苗，28 ℃恒溫培養箱培養7 d后，加入D600 nm=0.5的各菌株菌懸液5 mL，同條件繼續培養7 d，期間定期澆灌等量1/4MS營養液。7 d 后將水稻苗取出，抖凈石英砂，稱取0.1 g水稻根，加入含10 mL無菌水的錐形瓶，140 r/min渦旋振蕩30 min后，梯度稀釋涂布于LB平板，30 ℃培養2 d后計數，每組3次重復［24］。

1.2.7 水稻幼苗盆栽促生試驗

試驗共設8個處理組，分別為：CK（無菌水）、R8、K25、N2、T1（R8+K25，1：1）、T2（R8+N2，1 ∶1）、T3（K25+N2，1 ∶1）、T4（R8+K25+N2，1 ∶1 ∶1）。將催芽后萌發程度相近的水稻種子均勻播種后，將50 mL菌懸液（D600 nm=0.5）均勻噴灑于土壤表面。覆土 0.2 cm 并噴灑無菌水至基質含水量達到飽和狀態。每個處理重復5次。在相同室溫環境條件下，各處理隨機擺放，并定時隨機調整擺放位置，定期補充等量水分。21 d后采樣，測定水稻幼苗株高、莖粗、全株干質量、根干質量、根系總長、根總表面積、根總體積、根平均直徑、根尖數。根系相關指標使用根系分析儀（Scan Maker i800 plus）及根系分析軟件（Scan Wizard EZ）測定并分析。

1.2.8 數據處理

用SPSS 26軟件進行單因素方差分析，各試驗組間數據差異用Duncans法進行檢驗（α=0.05）。采用Origin 2021繪圖。

2 結果與分析

2.1 PGPR促生特性能力測定

從水稻根際土壤中初步篩選出80株根際促生菌，其中5株具有溶解無機磷能力、3株具有解鉀能力、3株具有固氮能力。對其促生特性能力進行測定，結果見表1。其中解磷能力最強的菌株為R8，7 d 發酵液中有效磷含量為33.94 μg/mL（磷標準曲線：y=1.530 6x-0.058 4，r2=0.991 9）。解鉀能力最強的菌株為K25，7 d發酵液中K+含量為 2.62 μg/mL。固氮能力最強的菌株為N2，7 d發酵液中N元素含量為3.05 μg/mL。在后續促生特性能力測定中發現，5株菌株具有產吲哚乙酸的能力，其中能力最強的菌株為K25，2 d發酵液中吲哚乙酸濃度達到93.87μg/mL（吲哚乙酸標準曲線：y=0.000 5x+0.005 4，r2=0.990 9）；9株菌株具有合成鐵載體的能力，其中能力最強的菌株為R8，2 d發酵液中鐵載體活性為56.97%；2株菌株具有分泌赤霉素的能力，其中能力最強的菌株為R8，2 d發酵液中赤霉素濃度為8.13 μg/mL（赤霉素標準曲線：y=0.060 5x+0.030 0，r2=0.990 5）。

2.2 確定目標菌株

從各菌株促生特性能力強弱以及功能多樣性的角度綜合分析，菌株R8具有最強的解磷和合成鐵載體能力，且具有產吲哚乙酸、赤霉素能力；菌株K25具有最強的解鉀能力、最強的產吲哚乙酸能力且可以合成鐵載體；菌株N2有最強的固氮能力且具有合成鐵載體的能力。所以選取此3株PGPR為目標菌株，并進行菌間交叉劃線拮抗試驗，結果為各菌株間相互不拮抗（圖1）。

2.3 菌種鑒定

生理生化試驗結果如表2所示。通過對菌落形態的觀察，菌株R8為黃色圓形不透明菌落，表面光滑濕潤，邊緣整齊。菌株K25為白色圓形不透明菌落，表面光滑干燥，邊緣整齊。菌株N2為乳白色圓形不透明菌落且具有黏性，表面光滑濕潤，邊緣整齊。通過對3株菌株的基因序列分別進行比對，構建系統進化樹（圖2、圖3、圖4）。結果表明，菌株R8、K25、N2分別與Pantoea eucalypti LMG24198、Enterobacter sichuanensis WCHECI1597、Bacillus zanthoxyli 1433處于同一分支，序列相似性分別為99.63%、99.30%、99.65%。綜上，3株菌株分別屬于泛菌屬、腸桿菌屬、芽孢桿菌屬，最終鑒定為桉樹泛菌、四川腸桿菌、花椒芽孢桿菌。3株菌株的序列上傳GenBank獲得的登錄號分別為OQ410706、OQ410707、OQ410708。

2.4 菌株生長曲線測定

由圖5可知，菌株R8、K25、N2的發育遲緩期持續時間不同，菌株R8、N2相同，為0～4 h；菌株K25發育遲緩期極短。菌株進入對數生長期后，迅速生長繁殖。菌株R8、K25、N2分別在16、16、22 h達到最高濃度，之后進入穩定期。

2.5 浸種促生試驗

由圖6-A、圖6-B可知，浸種促生7 d后，CK組水稻幼苗芽長為4.15 cm，與CK組相比，菌株R8、K25、N2菌懸液處理的水稻芽長分別提高25.06%、38.07%、55.66%；CK組水稻幼苗胚根長為6.98 cm，與CK組相比，菌株R8、K25、N2菌懸液處理的水稻胚根長分別提高15.19%、30.37%、47.42%；CK組水稻幼苗鮮質量為88.79 mg，與CK組相比，菌株R8、K25、N2菌懸液處理的水稻幼苗鮮質量分別提高13.27%、21.88%、46.93%；CK組水稻幼苗干質量為19.29 mg，與CK組相比，菌株R8、K25、N2菌懸液處理的水稻幼苗干質量分別提高30.38%、37.38%、49.82%。3株菌株的菌懸液對水稻幼苗均具有顯著的促進生長發育作用。

2.6 定殖試驗

在MS營養液試管苗定殖試驗中，3株PGPR在水稻根際均具有較好的定殖能力且差異顯著（圖7）。菌株K25定殖能力最強，達到了2.04×106 CFU/g。菌株R8定殖能力為1.10×106 CFU/g。菌株N2定殖能力顯著低于菌株R8、K25，為7.09×105 CFU/g。

2.7 水稻幼苗盆栽促生試驗

施加單一菌株與復合菌株的菌懸液21 d后，不同處理組對水稻各項生長指標的影響如圖8所示。與CK組相比，7組施加PGPR菌懸液的處理均顯著提高水稻幼苗的株高，提高幅度為19.04%～46.67%， 其中T4處理效果最佳（圖8-A）。 R8、T1、T4處理對莖粗提高幅度較大，對比CK處理增幅分別達31.75%、35.04%、39.05%（圖8-B）。在水稻幼苗干物質積累方面，添加PGPR的處理組對比CK組提高效果顯著（圖8-C、圖8-D），T3、T4處理顯著增加全株干物質積累量，增幅分別為24.71%、20.19%；T1、T2、T3、T4處理對根系干物質的積累量增幅為18.60%～22.09%，其中T3處理增幅最高。在植物根系結構方面，由圖8-E、圖 8-F、圖8-G、圖8-H、圖8-I可知，對比CK處理，各處理在根系總長、根平均直徑、根總體積、根總表面積、根尖數方面均有不同程度的提高，分別增加18.19%～99.64%、19.74%～68.35%、28.78%～107.73%、54.89%～147.52%、45.43%～101.04%。T3處理在根系總長、根總體積、根總表面積、根尖數方面優于其他處理，T4處理在根平均直徑方面優于其他處理。上述結果表明，篩選的3株水稻根際促生菌可以有效促進水稻幼苗的生長發育、改善水稻根系結構及促進植株干物質的積累。綜合分析，復合菌株處理組T3、T4對水稻幼苗總體促生效果優于其他單菌組與復合菌組。

3 討論與結論

本研究篩選出5株解磷菌、3株解鉀菌、3株自生固氮菌，并對其植物激素類物質分泌、養分轉化能力進行測定分析。最終確定3株促生能力優良且互不拮抗的目標PGPR，經鑒定分別為Pantoea eucalypti R8、Enterobacter sichuanensis K25、Bacillus zanthoxyli N2。在浸種促生試驗中，3株PGPR均表現出對水稻胚根長、胚芽長、苗鮮質量、苗干質量的顯著提高效果。PGPR的定殖同樣是其發揮促生作用的關鍵因素，PGPR需高效定殖于植物根際，競爭根系分泌物中的營養物質，發揮其正向作用，對植物產生有益影響［25］。本研究通過定殖試驗，證明3株PGPR均具有定殖于水稻根際的能力。在后續促生試驗中，單一菌株與復合菌株制備的菌懸液均顯示出不同程度的促生作用，T3、T4組復合菌株在促進水稻生長發育、改善根系結構、提高干物質積累方面表現出優于其他處理的效果。其原因可能是，PGPR間的協同作用多維度地促進根系生長，進而提高植株對土壤中水分和養料的吸收與利用，促進植株的生長發育及干物質的積累［26］。周靜等研究發現，4株PGPR菌液等比例混合，對辣椒幼苗株高、莖粗、鮮質量、葉綠素含量具有顯著提高作用［27］。大多數由單一菌株制備的菌劑，其促生功能較為單一，無法滿足農作物生長過程中的多種需求。由多菌種制備、具有多種功能的復合型菌劑已逐漸成為微生物菌劑研究及應用的一種趨勢［28］。韓梅等研究發現，互不拮抗的根瘤菌 S-2、溶磷菌P-3、硅酸鹽細菌K-5混合培養后的溶磷效果優于三者之和，S-2、P-3混合培養時的解鉀能力優于單一菌株［29］。綜上表明，復合菌劑中不同菌株間可能發生協同作用，所帶來的促生效果要優于單一菌株所制備的菌劑。本研究篩選出的PGPR復合菌株組合T3、T4對水稻具有良好的促生效果，具有研發制備微生物肥料的潛力。但由于本試驗是在實驗室穩定條件下進行的，PGPR的促生特性能否在田間土壤復雜的生態條件以及諸多生物與非生物因素影響下穩定發揮促生作用，仍須進一步驗證。在制備復合菌劑時，各菌株的配比以及復合菌劑應用中載體及劑型的選擇上，仍須進一步研究。

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