毒素-MS培養法鑒定百合對尖孢鐮刀菌的抗性

吳祝華 詹德智 施季森 席夢利

摘要：以宜昌百合為材料，通過在百合組織培養基中加入不同體積質量濃度的尖孢鐮刀菌毒素粗提液培養百合組培苗，建立了高效的百合抗尖孢鐮刀菌鱗莖腐爛病的鑒定體系，即在MS附加0.2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+蔗糖3%（質量分數，下同）+瓊脂6%（質量分數，下同），pH值為5.8的培養基中，加入100? mg/L尖孢鐮刀菌毒素粗提液，接種百合組培苗，觀察發病情況與計算病情指數來確定百合材料的抗病能力。以此鑒定體系對20份百合材料進行抗病鑒定，認為初夏、藥百合、淡黃花百合、岷江百合、雨荷、毛百合等為高抗種質，適合選為抗性育種親本；南川百合、瀘定百合、卷丹、川百合為中抗種質；卷丹（宜興百合）、青島百合、野百合、渥丹、金角、布魯內羅為中感種質，百合丹東種源、宜昌百合、細葉百合及百合為高感種質。本研究結果為百合抗性育種提供親本選擇的參考。

關鍵詞：尖孢鐮刀菌；毒素；百合；病情指數；抗性

中圖分類號：S682.2+65.01? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）24-0090-05

百合是世界第五大鮮切花，在我國廣泛生產栽培，但是尖孢鐮刀菌百合專化型（Fusarium oxysplorum f. sp.lilii）引起的鱗莖腐爛病一直是影響百合切花生產的產量與質量的主要因素［1-2］。為了培育抗病新品種，育種研究者希望能找到高抗種質。而我國百合資源豐富，對我國的百合資源進行尖孢鐮刀菌的抗性評價是獲得高抗種質的基礎。百合的抗性評價多采用田間接種觀察分級的方法，如李潤根等利用盆插鱗片接種菌塊，然后形態觀察鱗片感病程度并進行分級，來鑒定9種食用百合種質資源對枯萎病的抗性能，認為蘭州為高抗，鐵炮卷丹、 廣西高片、萬載柳片為中抗［3］。但該方法受栽培環境生態因子的影響。致病過程中起重要作用的毒素（如fusaric acid），尤其在病菌侵入寄主后，可引致維管束細胞產生褐變、壞死等病理變化［4-5］。以一定濃度的毒素粗提液添加到MS培養基中，離體培養百合鱗片，觀察其生長致病情況，對其抗性進行評價。該方法比田間接種方法更容易控制，環境與生長因子一致，使結論更科學客觀。彭綠春等采用百合尖孢鐮刀菌培養濾液，在瓶內對百合組培苗8 個品種進行鐮刀菌枯萎病抗性鑒定［6］。丁丁等對2個東方百合品種的愈傷組織附加不同濃度的枯萎病菌毒素粗提液，用于抗尖孢鐮刀菌無性系的離體篩選［7］。張藝萍等測定了百合抗病無性系和感病無性系在用尖孢鐮刀菌毒素誘導后的POD、PAL、PPO、β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質酶的活性變化，以揭示毒素篩選無性系的生化抗性機制，但前人的研究涉及種及品種較少［8］。我國百合資源豐富，是世界百合資源中心，筆者在此基礎上進一步改進百合品種鐮刀菌枯萎病抗性室內鑒定體系，對筆者所在實驗室收集、保存的16、2個品種及筆者所在實驗室選育的2個新品種進行抗性鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

尖孢鐮刀菌百合專化型致病菌株為云南農科院花卉所惠贈。百合材料為近年來南京林業大學百合課題組實驗室從我國西南、西北、華中、東北等地收集的野生百合種及栽培品種（表1）。其中，百合野生種有南川百合（L. rosthornii）、淡黃花百合（L. sulphureum）、岷江百合（L. regale）、宜興百合（L. lancifolium）、細葉百合（L. pumilum）、川百合（L. davidii）等16種；栽培品種有金角（Golden Horn）、布魯內羅（Brunello）以及筆者所在課題組選育的新品種初夏（Mid-May）、雨荷（Water Lily Dew）。供試的20種（含品種）百合均選擇鱗莖直徑約1 cm且具有數張基生葉的組培苗進行抗性鑒定。

1.2 試驗方法

1.2.1 百合專化型尖孢鐮刀菌毒素濾液的制備 試驗于2019年3—6月在南京林業大學林木遺傳育種實驗室進行。百合專化型尖孢鐮刀菌毒素濾液的制備參照文獻［5-6］中的方法并略加修改。供試菌株（FOX-2）接種于PSA平板培養基上25 ℃恒溫培養7 d，用內徑5 mm的打孔器沿菌落邊緣取菌片，接種于含200 mL改良Richard液體培養基的三角瓶中，每瓶接種5個菌片，置于25 ℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養28 d，每個處理重復3次。培養液經過4層紗布過濾除去菌絲體，收集濾液，再經孔徑0.45 μm微孔濾膜過濾，棄去沉淀，上清液即為尖孢鐮刀菌毒素濾液。取少量毒素在HEλIOSγ型紫外可見分光光度計上測濾液中的鐮刀菌酸（FA）濃度，剩余毒素濾液保存于4 ℃冰箱中。

1.2.2 鐮刀菌毒素濾液中FA含量的測定 以Sigma公司的鐮刀菌酸（fusaric acid，FA）為標準品，用HEλIOSγ型紫外分光光度計測定不同濃度（10、25、50、100 mg/L）下標準FA的紫外（λ=268 nm）吸收圖譜及吸光度，以光密度為縱坐標、FA濃度為橫坐標繪制FA標準曲線，并進行線性回歸，得到回歸方程。在HEλIOSγ型分光光度計上測定并計算濾液中FA的含量。在同一條件下測定毒素試樣的吸光度（D），根據以下公式計算出其中的毒素含量（以鐮刀菌酸計，mg/L）。

試樣鐮刀菌酸（FA）含量=（試樣D×標樣鐮刀菌酸含量）/標樣D。

1.2.3 MS-FA毒素篩選平臺的建立 將制備的百合專化型尖孢鐮刀菌毒素濾液按不同體積比加入百合MS組織培養基［MS附加0.2 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L NAA+蔗糖3%（質量分數，下同）+瓊脂6%（質量分數，下同），pH值5.8］中，配制成含毒素劑量分別為60、80、100? mg/L的毒素培養基，以宜昌百合為材料，將宜昌百合組培苗用刀片切去鱗莖基部一薄層后植入含毒素培養基中，每個處理5瓶，每瓶3株組培苗，以不含毒素的培養基為對照。毒素處理7 d后統計組培苗的發病率及病情指數。以每個處理3次重復的平均值作為結果。找出致病的最佳毒素濃度，而后用該濃度的FA-MS培養基對所有材料進行抗病評價。

病情調查標準和病害嚴重度分級標準參照文獻［7］中的方法。病害嚴重度：0級，無病癥；1級，<25％ 葉片黃化，鱗莖基部變褐色；2級，≥25％～50％葉片黃化，鱗莖外層鱗片腐爛；3級，≥50％～75％葉片黃化，鱗莖中度腐爛；4級，≥75％ 葉片黃化，鱗莖嚴重腐爛；5級，鱗莖完全腐爛，整株枯死。

病情指數計算公式為：病情指數=［∑（病級苗數×病級）/（苗數總和×發病最重級）］×100。

百合品種（種）抗性等級按樣本的平均病情指數劃分：高抗（HR）<20.0，中抗（MR） 20.0～<50.0，中感（MS）50.0～<80.0，高感（HS）≥80.0。

1.2.4 試驗材料抗性鑒定 以“1.2.3”節中建立的篩選平臺對20種（含品種）百合組培苗進行抗性測定。百合組培苗移植到含毒素培養基上，處理7 d后統計組培苗的發病率及病情指數。每個處理3次重復。

2 結果與分析

2.1 最適培養基毒素濃度篩選

根據鐮刀菌酸標準品在紫外分光光度計上于268 nm處測定的吸光度值繪制鐮刀菌酸（FA）濃度標準曲線，計算出FA濃度與其吸光度值的線性回歸方程：y=0.027 1 x+0.265 7，相關系數r=0.971 8，其中：y為吸光度；x為FA濃度，mg/L。

根據鐮刀菌酸濃度標準曲線計算鐮刀菌培養濾液中FA的濃度，將濾液添加到百合MS培養基中，配制成FA濃度分別為60、80、100 mg/L的 FA-MS 培養基，接種宜昌百合組培苗并觀察記錄發病情況。7 d后接種的組培苗相繼發病，其中含100 mg/L FA培養基上組培苗發病最早，病情也最為嚴重，80 mg/L FA培養基的病情次之，60 mg/L FA培養基上百合組培苗發病最晚，15 d后才表現出明顯發病癥狀（表2）。

由不同濃度毒素對宜昌百合組培苗的致病性結果（表2）可見，培養基中毒素濃度越高，對百合的致病作用越強。隨著毒素處理時間的延長，百合組培苗的病情逐漸加重。

與接菌處理試驗相比，在毒素培養基上接種的百合組培苗發病所需時間較短，以宜昌百合為例，接種10 d左右即表現出明顯的發病癥狀，而直接接菌往往需要15 d或更長時間才能表現出明顯的發病癥狀，說明采用尖孢鐮刀菌毒素濾液代替病原菌進行抗性試驗能夠縮短試驗周期，可實現對品種抗性的快速鑒定。

試驗表明，當培養基中FA濃度為60 mg/L時，培養后15 d宜昌百合組培苗表現輕度萎蔫，葉片卷曲，鱗莖外層鱗片軟腐；當培養基中FA濃度為 80 mg/L 時，組培苗表現中度萎蔫，基本鱗片褐色，呈輕度腐爛；當FA濃度達100 mg/L時，組培苗葉片大部分枯萎，鱗莖重度腐爛（圖1）。

從表2、圖1可以看出，隨著培養基中FA濃度的升高，宜昌百合組培苗的發病程度逐漸加重。培養基中FA濃度達60 mg/L時，組培苗病情指數較低，10 d時病情指數僅15.3，20 d后病情指數仍在30以下，FA低濃度時材料發病癥狀不夠明顯，這會導致品種間的病情指數區分度較低。當培養基中FA濃度達100 mg/L以上時，材料病癥明顯，10 d時組培苗病情指數為44.8，20 d后病情指數達75.2，材料病癥明顯，便于觀測記錄，表明培養基中FA濃度100 mg/L為較適宜的抗性鑒定濃度。

2.2 百合不同品種對鐮刀菌毒素的抗性

以附加尖孢鐮刀菌毒素濾液的FA-MS培養基（含FA 100 mg/L）為篩選平臺，對20種（含品種）百合組培苗進行抗性測定。百合組培苗移植到含毒素培養基7 d后開始發病，主要表現為葉片枯黃，鱗片基部變褐腐爛。據百合莖腐病發病等級標準，統計病情指數，依據百合莖腐病病情分級標準對20個百合種（品種）進行抗性分級（表3）。

抗性鑒定結果表明，不同百合種（品種）的抗性水平存在顯著差異。淡黃花百合等6個百合種（品種）對尖孢鐮刀菌毒素濾液表現高抗，而百合丹東種源、宜昌百合等品種對尖孢鐮刀菌毒素濾液表現高感。據病情分級標準鑒定出高抗種（品種）6個，中抗種（品種）4個，中感種（品種）6個，高感種（品種）4個。方差分析結果表明，不同百合種質的病情指數存在顯著差異（表3）。

由表4可以看出，20種百合材料的病情指數存在顯著差異，而病情指數客觀反映了百合品種的抗病性，因而試驗結果也說明百合不同品種的抗性存在著顯著差異，在此基礎上依據病情指數對20種百合材料抗病性的差異進行多重比較（表5）。

由表5可以看出，初夏、藥百合、淡黃花百合及岷江百合的抗性較強，它們與雨荷、毛百合等高抗種（品種）差異極顯著。而高抗種（品種）雨荷、毛百合，中抗種南川百合、瀘定百合差異不顯著。而百合（丹東種源）、宜昌百合、細葉百合及百合等對鐮刀菌莖腐病的抗性較差，與其他材料達極顯著差異。

3 結論與討論

尖孢鐮刀菌及其產毒素的致病性對比試驗表明，鐮刀菌培養后的毒素濾液可以代替病原菌進行品種的抗性鑒定。將毒素濾液添加到百合組培培養基中制成的FA-MS培養基可以作為百合種質抗性鑒定的平臺，運用此方法可以快速篩選出對百合莖腐病有較強抗性的百合種質資源。在一定濃度范圍內，百合組培苗的病情指數與毒素濾液中鐮刀菌酸（FA）的濃度成正比，隨毒素處理時間延長而病情加重。FA-MS培養基中適宜的FA濃度為 100 mg/L 左右，FA濃度過低或過高均不利于百合抗性的鑒定。

百合對尖孢鐮刀菌的抗性與寄主植物發育階段、病原菌生理小種及環境條件等多種因素有關。百合在苗期的抗性與其在成株期的抗性是否完全一致目前尚不明確。但由于百合苗期植株抗病力相對較弱，尖孢鐮刀菌容易侵染而致病，因而植物病原菌的抗性試驗多在苗期進行。百合田間抗性一般不很穩定，受環境條件影響較大。本試驗主要研究百合屬部分種質資源對百合專化型尖孢鐮刀菌的垂直抗性，而非水平抗性，由于百合專化型鐮刀菌至少發現具有3個生理小種，除百合專化型尖孢鐮刀菌外，還有茄腐皮鐮刀菌［F. solani （Mart） Sacc］、串珠鐮刀菌（F. moniliform Sheldon）、三線鐮刀菌（F. tricinctum）［9］和 富士鐮刀菌（F. fujikuroi）［10］，它們的發生頻率遠低于尖孢鐮刀菌，但它們有時和尖孢鐮刀菌復合發生。對尖孢鐮刀菌有較強抗性的百合品種是否也對后2種鐮刀菌有較強抗性還不清楚，尚有待進一步研究。

本研究依據不同百合種（品種）百合對尖孢鐮刀菌毒素濾液的病理反應將供試的20個百合品種分為4類，初夏、藥百合、淡黃花百合、岷江百合、雨荷、毛百合等為高抗種（品種），適合選為抗性育種親本。南川百合、瀘定百合、卷丹、川百合為中抗種質。卷丹（宜興百合）、青島百合、野百合、渥丹、金角、布魯內羅為中感種質，百合（丹東種源）、宜昌百合、細葉百合及百合為高感種質。本研究結果與李潤根等的研究［3］表明卷丹為中抗種質相一致。

筆者所在課題組選育的新品種初夏、雨荷均比親本金角、布魯內羅抗性增強，可能是由于親本為二倍體與四倍體，而子代為三倍體增強了抗性。

近年來，隨著基因與蛋白組學研究的進步，百合尖孢鐮刀菌抗性基因挖掘工作相繼展開，王自娥認為岷江百合defensin抗菌肽基因LrDef1是一個尖孢鐮刀菌抗性基因，LrWRKY3通過與LrDef1啟動子中的W-bo特異性結合并激活其轉錄，調控LrDef1的表達參與岷江百合與尖孢鐮刀菌的分子互作［11］。李珊的研究表明，岷江百合幾丁質酶基因LrCHI2響應植物信號分子處理和尖孢鐮刀菌侵染。原核重組蛋白LrCHI2對包括尖孢鐮刀菌在內的幾種病原真菌具有明顯的抑制活性［12］。

在蛋白組學方面，張藝萍等以東方百合品種卡薩布蘭卡抗病無性系和感病無性系為試驗材料，開展百合抗尖孢鐮刀菌枯萎病的蛋白質組學研究，發現與防御反應的病程相關蛋白（推定的抗病蛋白RPS2、推定的抗晚疫病同族蛋白R1C-3、過氧化物酶Q、抗壞血酸過氧化物酶和NBS-LRR類似蛋白）可能是百合抗病無性系介入抗病防御反應的關鍵蛋白［13］。

但上述研究的材料集中在岷江百合與東方百合品種上，根據本研究結果可知，高抗種質初夏、藥百合、淡黃花百合、毛百合以及品種雨荷等均可作為高抗種質進行進一步的抗性基因挖掘。

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