2-乙基己酯-4-甲氧基肉桂酸（EHMC）對斑馬魚早期生命階段的毒性效應

鄭夢嫣，周芳琦，王泓鍇，趙一新，劉尚書，胡豐曉,2

（1.福建農林大學海洋研究院，福建 福州 350002；2.福建省海洋生物技術重點實驗室，福建 福州 350002）

有機紫外吸收劑能夠保護人體皮膚免受紫外線（UV）輻射[1,2]，被廣泛地添加到防曬霜、口紅、洗發水等各種個人護理品中[3,4]。2-乙基己酯-4-甲氧基肉桂酸（2-ethylhexyl-4-methoxycinnamate，EHMC）是三種最常見的有機紫外吸收劑之一[5]，具有較強的親脂性[6]，易于在水生生物體內富集。防曬霜等個人護理品的廣泛使用，EHMC 不斷被釋放到水體中[7]，目前已在多種環境介質和生物組織中被檢出。瑞士未經處理的城市廢水中EHMC 最高濃度為19 μg·L-1[8]。西班牙埃布羅河流域沉積物中檢測到EHMC 含量為42 ng·g-1[9]。澳大利亞格雷芬湖中甲殼動物、斑馬貽貝（Dreissena polymorpha）和各種魚類體內檢測出EHMC 的含量最高依次為133 ng·g-1、150 ng·g-1和337 ng·g-1,通過食物鏈產生生物放大效應，在鸕鶿（Phalacrocorax carbo）體內的含量可高達701 ng·g-1[10]。

EHMC 對水生生物表現出多種毒性效應，如神經毒性、生殖毒性和甲狀腺激素干擾效應等[11-13]。Chu[14]等研究發現，成年斑馬魚（Danio rerio）暴露于EHMC 全身三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）和甲狀腺素（Thyroxine，T4）含量降低，甲狀腺激素相關基因下調，影響成年雄魚腎毒性相關基因的轉錄。魚的早期生命階段對外界環境改變尤其敏感，魚類胚胎發育檢測技術具有操作簡單、成本低、靈敏度高、重現性好等優點而被廣泛用于毒性檢測[15]。研究顯示，很多藥物及個人護理品（Pharmaceutical and Personal Care Products，PPCPs）對斑馬魚仔魚具有發育毒性，包括生長抑制效應。斑馬魚胚胎直接暴露于卡培他濱（Capecitabine，CAP）[16]，會導致胚胎死亡率和畸形率增加。斑馬魚胚胎/幼魚暴露于鹽酸四環素（Tetracycline hydrochloride，TH）和苯扎貝特（Bezafibrate，BF）后[17]，體質量顯著下降。斑馬魚胚胎暴露于高濃度（500 μg·L-1）他莫昔芬（Tamoxifen，TAM）[18]，幼魚體長變短?；前芳讗哼颍⊿ulfamethoxazole，SMZ）暴露，斑馬魚胚胎/幼魚、仔魚體長變短[19]。然而，EHMC 對于魚類早期生命階段的毒性效應研究尚未見報道。

本實驗通過測定斑馬魚胚胎暴露在EHMC 下的存活率、心率和孵化率、仔魚畸形率和體長等參數，檢測魚體生長激素（growth hormone，GH）和胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF-Ⅰ）含量及GH/IGF-I 軸相關基因的轉錄水平，以探討EHMC 對斑馬魚早期生命階段的毒性影響，并為EHMC 的水生生態安全性評價提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

2-乙基己酯-4-甲氧基肉桂酸（EHMC）純度為97%，阿達瑪斯試劑（中國）公司；二甲亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）分析純，阿拉丁科技（中國）有限公司；斑馬魚生長激素（GH）試劑盒，南京建成生物工程研究所；斑馬魚胰島素樣生長因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）試劑盒，南京建成生物工程研究所；Fast-PureCell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；HiScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper），南京諾唯贊生物科技股份有限公司；ChamQTM Universal SYBRqPCR Master Mix，南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

實驗用成年野生型斑馬魚購自國家斑馬魚資源中心，在實驗開始前1 個月，在曝氣的自來水當中進行14 h 光照和10 h 暗循環馴化。水溫保持在（28.0±1）℃，pH7.0～8.0，溶解氧含量不低于7 mg·L-1，每日換水一次，親魚每天投喂剛孵出的鹵蟲幼蟲2次，熱帶觀賞魚飼料1 次，并及時清除多余飼料和排泄物。

1.2 方法

EHMC 試劑配制：加入體積濃度為0.1%DMSO助溶劑,使EHMC 完全溶解。對照組只加入等量助溶劑（EHMC，0 μg·L-1），三個實驗組EHMC 劑量為2 μg·L-1、20 μg·L-1和200 μg·L-1，每個濃度設置三個平行，每個平行100 粒受精卵。提前準備消毒好的繁殖缸，實驗前12 h 放入10 對性腺發育成熟的雌、雄斑馬魚，水溫保持在28℃，12 h 后收集受精卵。收集到的受精卵用清水多次清洗，確保受精卵無破損，表面無污物。

1.3 實驗指標測定方法

1.3.1 斑馬魚胚胎/幼體的發育毒性的檢測

每個濃度取100 粒受精卵，共1 200 粒受精卵。暴露期間保持光周期10 h∶14 h，每24 h 更換1/4相應濃度的暴露液一次。暴露開始后48 h、72 h、96 h進行鏡檢觀察，記錄不同時期的死亡、畸形。每個平行隨機選取9 尾斑馬魚測量心率、體長等。胚胎暴露120 h 結束暴露時，每個平行收集30 尾斑馬魚幼魚，用于后續測定生長激素含量。每個平行收集50尾斑馬魚幼魚，在液氮中快速冷凍后，儲存在超低溫冰箱（-80℃）中，用于后續mRNA 表達水平測定。

1.3.2 斑馬魚生長激素（GH）和胰島素樣生長因子（IGF-Ⅰ）檢測

斑馬魚幼魚全魚勻漿，采用斑馬魚生長激素（GH）和斑馬魚胰島素樣生長因子（IGF-Ⅰ）ELISA檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定GH 和IGF-Ⅰ含量，實驗步驟和計算公式參照試劑盒說明書。

1.3.3 基因表達分析

將有裂解緩沖液的整體斑馬魚樣本勻漿，4℃以3 000 r/min 離心10 min。收集上清，立即按照FastPureCell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2 試劑盒說明書提取RNA。再用HiScriptⅡQ RT Super-Mix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒進行逆轉錄合成cDNA。用ChamQTM Universal SYBRqPCR Master Mix 試劑盒進行qRT-PCR 反應，每個PCR體系共20 μL。以rpl8 為內參基因，用2-ΔΔCt方法計算各基因的相對表達量。目標基因和內參基因的引物序列見表1。

表1 實驗用引物序列Tab.1 Nucleotide sequences of primers used in present study

1.4 數據處理

數據以平均值±標準差表示,采用SPSS 21.0 統計分析軟件,在P=0.05 的置信水平對斑馬魚生理生化指標的數據進行單因素方差分析,并用Origin 2018 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 EHMC 對斑馬魚胚胎/幼體的發育毒性

實驗結果如圖1-A 所示，斑馬魚胚胎暴露于EHMC 48 hpf（hours post fertilization）時，20 μg·L-1暴露組的心率與對照組相比顯著下降（P＜0.05）；72 hpf時，2 μg·L-1、20 μg·L-1組的斑馬魚胚胎心率與對照組相比均無顯著差異（P＞0.05），200 μg·L-1組的斑馬魚胚胎心率與對照組相比顯著下降（P＜0.05）；96 hpf 時，2 μg·L-1、20 μg·L-1和200 μg·L-1組的斑馬魚心率與對照組相比均顯著下降（P＜0.05）。

如圖1-B 所示，斑馬魚胚胎暴露于EHMC 72 hpf 和96 hpf 時，200 μg·L-1組的幼魚體長與對照組相比顯著變短（P＜0.05），2 μg·L-1、20 μg·L-1組的幼魚體長與對照組無顯著差異（P＞0.05）。

如圖1-C 所示，斑馬魚胚胎暴露于EHMC 96 hpf 時，所有實驗組的孵化率與對照組均無顯著差異（P＞0.05）。如圖1-D 所示，斑馬魚胚胎暴露于EHMC 96 hpf 時，200 μg·L-1組幼魚的畸形率顯著升高（P＜0.05），其他暴露組無顯著影響（P＞0.05）。由圖2 可見，斑馬魚幼魚暴露于EHMC 96 hpf 時的幾種典型畸形：圖2-A 為正常斑馬魚；圖2-B 為卵黃囊水腫（Yolk sac edema，YSE）、心包囊水腫（Pericardial edema，PE）；圖2-C 為尾巴變形（Tail deformation，TD）；圖2-D 為脊柱變形（Bend spine，BS）。

圖1 EHMC 暴露對斑馬魚心率、體長、孵化率（96 hpf）、畸形率（96 hpf）的影響Fig.1 Effects of EHMC exposure on heart rate,body length,malformation（96 hpf）and hatchability（96 hpf）of zebrafish

圖2 96 hpf 時斑馬魚幼魚典型的畸形情況Fig.2 Typical malformations of zebrafish larvae at 96 hpf

2.2 斑馬魚體內GH 和IGF-Ⅰ含量的測定

斑馬魚在EHMC 暴露120 hpf 時,體內GH 和IGF-Ⅰ含量變化如圖3 所示.EHMC 暴露濃度為2 μg·L-1和20 μg·L-1時，斑馬魚體內GH 和IGF-Ⅰ的含量顯著上升（P＜0.05），EHMC 暴露濃度為200 μg·L-1時，斑馬魚體內GH 含量與對照組無顯著變化（P＞0.05），而體內IGF-Ⅰ含量與對照組相比顯著降低（P＜0.05）。

圖3 120 hpf 時斑馬魚體內GH 和IGF-Ⅰ的含量Fig.3 The contents of GH and IGF-Ⅰin 120 hpf zebrafish exposed to EHMC

2.3 斑馬魚體內GH 和IFG-ⅠmRNA 表達水平測定

如圖4 所示，斑馬魚在EHMC 暴露至120 phf時，2 μg·L-1暴露組的ghra、ghrb、igf-2a、igf-2b、igf-1rb 和igf-2r mRNA 表達量顯著上調（P＜0.05）。20 μg·L-1暴露組ghrh、gh、ghra、ghrb、igf-1、igf-2a、igf-2b、igf-1ra、igf-1rb 和igf-2r 的mRNA 表達量顯著上調（P＜0.05）。200 μg·L-1暴露組ghrh、gh、ghra和igf-1 的mRNA 表達量顯著下調（P＜0.05）。

圖4 斑馬魚體內GH/IGF-Ⅰ軸基因的mRNA 表達水平Fig.4 mRNA expression levels of GH/ IGF-Ⅰaxis genes in zebrafish

3 討論

EHMC 是有機紫外吸收劑的重要組成成分，有較強的親脂性，易于在水生生物體內富集，可通過多種途徑進入魚體內造成負面影響。本研究考察了EHMC 暴露下斑馬魚胚胎心率、孵化率、畸形率、體長等發育參數變化以及與生長發育相關的激素水平及GH/IGF 軸基因的表達情況，以探究EHMC 對斑馬魚早期生命階段的影響。

心率是斑馬魚胚胎毒性測試中重要的亞致死毒理學終點。胚胎發育過程中心臟是最早發生并發揮生理功能的器官，完善的循環功能對于胚胎的正常發育起著關鍵作用。本研究中，隨著時間的增加，所有EHMC 暴露組的斑馬魚心率與對照組相比均顯著下降。這表明EHMC 暴露可以影響斑馬魚胚胎和幼魚的心臟發育，干擾心臟的正常生理功能。本研究中，EHMC 暴露對斑馬魚的孵化率未產生顯著影響，但高濃度的EHMC（200 μg·L-1）導致幼魚畸形率顯著升高。典型的畸形主要包括卵黃囊水腫、心包水腫、尾部變形等，這與Diana[20]等研究的另一種重要的有機紫外過濾劑4-甲基芐亞基樟腦（4-Met hylbenzylidene camphor，4-MBC）暴露青蛙（Rana nigromaculata）胚胎引起的畸形結果相似。有學者將卵黃囊水腫作為毒物誘導魚類肝毒性的觀察指標之一[21]。本研究結果說明，高濃度的EHMC 可能對斑馬魚幼魚的肝臟具有毒性作用。脊柱及尾巴彎曲說明EHMC 對斑馬魚早期生命階段的骨骼發育有明顯的致畸作用。本研究首次發現高濃度的EHMC（200 μg·L-1）暴露會引起斑馬魚幼魚體長明顯下降，與Liang 等[22]研究的高濃度4-MBC（500 μg·L-1）暴露會導致青鳉（Oryzias latipes）體長顯著下降結果相似，表明高濃度的EHMC 暴露對斑馬魚早期生命階段具有生長抑制效應。斑馬魚心率下降會造成營養物質缺失，生長緩慢[23]，因此EHMC 引起心率下降可能是抑制生長的重要原因。

GH/IGF-I 軸是魚類生長發育的重要調控軸，外源物質可能直接作用于該軸，擾亂GH、IGF-I 等因子的表達，干擾魚類的生長發育。GH 是調控魚類生長最為關鍵的因子，主要通過IGF-Ⅰ介導的間接方式促進靶細胞的增殖和生長，也可直接刺激靶細胞促進生長[24,25]。IGF-Ⅰ是一類具有胰島素樣代謝和促有絲分裂功能的多肽[26]，可以通過血液循環反饋神經內分泌因子和GH 的合成與分泌。外源物質暴露能干擾GH/IGF 軸相關基因的轉錄表達，影響生長調控。如鎘、3,4-二氯苯胺、林丹及對硫磷[27,28]等化學物質能直接影響GH/IGF-I 軸抑制斑馬魚的生長。本研究中，低濃度EHMC 暴露使斑馬魚體內GH和IGF-Ⅰ的含量顯著升高，而高濃度暴露體內GH含量與對照相比無顯著差異，但體內IGF-Ⅰ含量卻顯著降低。由此推斷，高濃度EHMC 引起的生長抑制可能是由IGF-I 的下降所致。基因轉錄分析顯示，高濃度的EHMC 暴露引起ghrh 和gh 的mRNA表達量顯著下調，與幼魚體內GH 水平變化趨勢相反，具體原因尚待進一步研究。高濃度EHMC 暴露組中ghra 及igf-1 的轉錄水平顯著下降，因此，EHMC 可能是通過下調生長激素受體表達來降低IGF-I 的表達和分泌，抑制幼魚的生長。

綜上所述，EHMC 暴露對斑馬魚早期生命階段表現出發育毒性，包括降低心率，提高畸形率。高濃度EHMC 對幼魚表現出生長抑制效應，可能與魚體中IGF-Ⅰ的含量下降以及GH/IGF 軸基因ghra 及igf-1 轉錄水平的降低有關。