“魚-植物”共生模式下不同植物根際細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)研究

胡建勇，李曉東，翟旭亮，時春明，焦飛，高攀

（1.新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北地區(qū)漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實驗站，新疆 烏魯木齊 830000；2.重慶市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，重慶 400020）

“魚-植物”共生模式是通過植物吸收利用養(yǎng)殖水體中氮、磷的一種綜合種養(yǎng)模式，因此，提高氮磷的利用效率對該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有現(xiàn)實意義[1]。研究表明，植物對氮磷吸收與利用效率受種類等多方面因素的影響。水稻（Oryza sativa）對氮素的利用效率隨施氮量的增加而下降[2]；與鳳眼蓮（Eichhornia crassipes）和水芹菜（Oenanthe javanica）相比，水蕹菜（Ipomoea aquatica）對富營養(yǎng)化水質(zhì)凈化效果表現(xiàn)更加優(yōu)秀[3]；進一步研究發(fā)現(xiàn)，植物根系微生物中有益菌群能夠提升植物營養(yǎng)元素的吸收與利用效率，促進植物生長發(fā)育，周冬梅等[4]，柏文戀等[5]認(rèn)為，根系微生物能夠促進土壤中難溶態(tài)無機磷溶解和有機磷的礦化，促進磷的利用。而在“魚-植物”共生模式應(yīng)用的實踐中，提高水體中氮磷利用效率的主要方法為多種植物組合模式，彭剛[6]利用“挺水植物荷花（Nelumbo）、蘆葦（Phragmites australis）等+沉水植物植物苦草（Vallisneria natans）、伊樂藻（Elodea nuttallii）等+浮水植物水葫蘆（Eichhornia crassipes）、浮萍（Lemna minor）等”的聯(lián)合凈化模式去除了水體中50%～70%的氮磷。基于上述研究進展，為解決新疆地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖面臨的尾水生態(tài)治理的技術(shù)瓶頸，作者開展了以魚菜共生為代表的“魚-植物”綜合種養(yǎng)模式的應(yīng)用，取得了良好的效果。但提高共生植物對不同類型尾水氮、磷利用效率，需要強化不同植物的協(xié)同作用，重視其根際微生物的作用。為此，本文利用高通量測序技術(shù)分析了水稻、茨菰、水蕹菜、水芹菜、蘇丹草等植物根系細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，同時采集植物種植區(qū)水樣進行水質(zhì)分析，研究“魚-植物”共生模式下不同植物根系細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)與水體中氮、磷含量的關(guān)系，以期為進一步豐富“魚-植物”共生理論，為加快該技術(shù)的推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以水稻（Oryza sativa）、茨菰（Sagittaria sagittifolia）、水蕹菜（Ipomoea aquatica）、水芹菜（Oenanthe javanica）和蘇丹草（Sorghum sudanense）為研究對象；其中水稻品種為秋田小町，經(jīng)育苗，大田生長；茨菰購自烏魯木齊米東區(qū)種植戶；水蕹菜購自烏魯木齊新市區(qū)種植戶；蘇丹草采用種子直播法；水芹菜購自湖北省黃岡市。上述植物于5 月25 日定植于花盆，每種植物定植16 盆，隨后置于植物浮床，種植于新疆水生野生動物救護中心循環(huán)水養(yǎng)殖池塘，其養(yǎng)殖模式為浮式平臺養(yǎng)殖模式：構(gòu)建養(yǎng)殖單元和生態(tài)凈化單元，養(yǎng)殖單元為8 個直徑3 m、高1.2 m 的圓形漂浮養(yǎng)殖池，配置水循環(huán)和集排污、增氧系統(tǒng)，分別放養(yǎng)易捕鯉（211.35±14.19）g/ 尾、松浦鏡鯉（212.36±15.65）g/ 尾，放養(yǎng)密度均為10 kg/m3水體；生態(tài)凈化單元放養(yǎng)500 g 以上的鰱100 尾/667m2、鳙50 尾/667m2，并利用本試驗所用植物凈化水質(zhì)。8 月25 日剪取一定長度的植物根系經(jīng)PBS緩沖液（pH7.4）漂洗后，置于20 mL PBS 緩沖液（pH=7.4）中，搖床震蕩30 min 后經(jīng)4℃12 000 r/min離心5 min 富集根系土壤備用；同時采集植物種植區(qū)水樣，部分經(jīng)4℃12 000 r/min 離心5 min 富集備用，其他用作水質(zhì)分析。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取

根系及水樣微生物DNA 提取使用OMEGA 公司E.Z.N.ATM Mag-Bi-nd Soil DNA 試劑盒并經(jīng)凝膠檢測后備用。

1.2.2 PCR 擴增及高通量測序

根系及水樣微生物DNA 使用Life 公司Qubit2.0 DNA 試劑盒精確定量后，用上海生工的細(xì)菌16S rDNA 通用引物進行第一輪擴增。引物序列如下：341F：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG；805R：GACTGGAG TTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA（barcode）GACTA CHVGGGTATCTAATCC。上述PCR 產(chǎn)物引入Illumina 橋式PCR 兼容引物進行第二輪擴增后，用0.6倍的磁珠（Agencourt AMPure XP）富集后經(jīng)Life 公司Qubit2.0 DNA 試劑盒精確定量后委托上海生工使用Illumina MiseqTM平臺測序。

1.2.3 水質(zhì)測定

水樣的采集、貯存、運輸和處理具體參照GB/T12999-91，氨氮（NH4+-N）含量采用納氏試劑比色法（GB7479-87）測定；亞硝酸鹽氮（NO2--N）含量采用萘乙二胺分光光度法（GB7493-87）測定；硝酸鹽氮（NO3--N）含量采用酚二磺酸分光光度法（GB7480-87）測定；總氮（TN）含量采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法（GB11894-89）測定；總磷（TP）含量采用鉬酸銨分光光度法（GB11893-89）測定。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

測序結(jié)果經(jīng)去除接頭、引物序列后拼接、過濾、去除嵌合體，最終得到可用于劃分操作分類單元（Opera-tional taxonomic units，OTU）的序列數(shù)。水質(zhì)試驗結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行關(guān)聯(lián)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物根系細(xì)菌群落多樣性

水稻（OS-1）、茨菰（ST-1）、水蕹菜（IA-1）、水芹菜（OJ-1）、蘇丹草（SS-1）和水樣（W-1）共得到有效OTU 數(shù)見表1。

由表1 可知，在“魚-植物”共生模式下，不同植物根系細(xì)菌群落測序所得序列數(shù)差異極大，最高的茨菰是最低的水芹菜的1.7 倍。為了更好地反應(yīng)研究的真實情況，本試驗構(gòu)建了各樣品OTU 的韋恩圖（圖1）和樹狀結(jié)構(gòu)（圖2）。

圖1 不同樣品OTU 數(shù)花瓣圖Fig.1 Petal graph based on OTUs of different sample

表1 測序數(shù)據(jù)處理結(jié)果Tab.1 The results of sequencing data

圖2 不同樣品OTU 數(shù)聚類樹圖Fig.2 Bray-crutis tree of different samples OTUs

由圖1 可知，不同植物在“魚-植物”共生模式下根系細(xì)菌OTU 絕大部分為特有類型，彼此間差異極大，除水樣外，水蕹菜最高，蘇丹草最低。由圖2可知，除水樣外，茨菰和水稻聚于一個分支，說明它們的OTU 相似性較高，這可能與它們同屬單子葉植物有關(guān)；而蘇丹草與其他四種植物差異最大，這可能與其原本為陸生植物有密切關(guān)系。基于高通量的測序技術(shù)是研究根系微生物群落結(jié)構(gòu)的主要手段，但對于該技術(shù)而言，保證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性即需要準(zhǔn)確反映被測樣本微生物群落的豐度和多樣性。為此，本課題組構(gòu)建了稀釋曲線（圖3）和Rank-abundance 曲線（圖4）。

由圖3 可知，隨著擴增數(shù)的增加稀釋曲線逐漸平緩，表明隨著擴增數(shù)的增加產(chǎn)生新的OTU 的概率低，說明本研究的測序數(shù)據(jù)合理。而圖4 中各條曲線凸凹不平，說明在“魚-植物”共生模式下，各植物根系細(xì)菌群落組成均勻度低，不同種類菌群差異較大。本研究通過基于RDP classifier 分類方法，在科（family，圖5）、屬（genus，圖6）水平上對以上5 種植物根系細(xì)菌菌群進行了分類分析，同樣證實了不同植物在同一種植模式下根系細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)據(jù)巨大差異。

圖3 稀釋曲線Fig.3 Rarefaction curve of samples

圖4 Rank-abundance 曲線Fig.4 Rank-abundance curve of samples

圖5 科水平上不同處理樣品物種豐度Fig.5 Abundance of species with different treatments on family level

圖6 屬水平上不同處理樣品物種豐度Fig.6 Abundance of species with different treatments on genus level

2.2 根系細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與池塘水質(zhì)關(guān)聯(lián)性分析

在池塘“魚-植物”共生模式下，水體是植物所需氮、磷及其他營養(yǎng)元素的唯一來源；水體中的氮、磷濃度能夠影響植物的生長發(fā)育；而根系中的有益微生物菌群又有利于植物對各類營養(yǎng)元素的吸收。鑒于此，本研究對水質(zhì)分析結(jié)果（表2）同上述五種植物根系細(xì)菌種群含量均高于0.1%的優(yōu)勢菌群在科屬水平進行相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以下各科（包括Planctomycetaceae、Enterobacteriaceae、Aeromonadaceae、Flavobacteriaceae、Sphingomonadaceae、Comamonadaceae、Acidimicrobiaceae、Rhodocyclaceae、Chitinophagaceae、Burkholderiaceae、Ectothiorhodospir aceae、Caldilineaceae、Desulfobacteraceae 和 Parachlamydiaceae）、各屬（包括Rhodobacter、Ilumatobacter、Novosphingobium、Dechloromonas、Aquisphaera、Enterobacter、Pirellula、Ralstonia、Hydrogenophaga、Litorilinea、Arenimonas、Phreatobacter、Bosea 以及Planctomicrobium）與水體中的N、P 含量呈顯著（P＜0.05）或極顯著相關(guān)性（P＜0.01）（表3）。

表2 “魚-植物”共生模式的水質(zhì)測定結(jié)果Tab.2 The results of water quality in the“fish-plant”symbiosis system

表3 水質(zhì)與植物根系細(xì)優(yōu)勢菌群在科、屬水平上的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis of water quality and plant shizosphere microflora at family and genus levels

3 討論

3.1 根系細(xì)菌與植物種類、生長環(huán)境的關(guān)系

植物根系對營養(yǎng)元素的吸收、利用與生長環(huán)境密切相關(guān)；同時，根系菌群在參與相關(guān)生理活動中起著重要作用。因此，研究植物生長環(huán)境與根系微生物群落結(jié)構(gòu)關(guān)系將對提高植物對營養(yǎng)元素利用效率、增強抗逆性具有重要意義。例如，在鹽堿環(huán)境中堿蓬（Suaeda glauca）根系中Echinicola 屬、蘆葦中Bacillus 屬和Filobacillus 屬菌群具有較高豐度[7]；而在人工濕地中，相比梭魚草（Pontederia cordata）和再力花（Thalia dealbata Fraser），美人蕉（Canna indica L.）根系具有較高的菌群多樣性[8]。這說明同一生長環(huán)境下，植物根系微生物菌群結(jié)構(gòu)與植物的種類密切相關(guān)，在荒漠環(huán)境下，半日花（Helianthemum songaricum）中優(yōu)勢屬為Sphingomonas、Gemmatimonas、Aciditerrimonas、Pseudomonas、Adhaeribacte而四合木（Tetraena mongolica）中的Sphingomonas、Gemmatimonas、Aciditerrimonas、Steroidobacter、Streptophyta 為優(yōu)勢屬[9]；現(xiàn)有證據(jù)表明，植物根系分泌物類別和數(shù)量能夠影響植物根系微生物群落結(jié)構(gòu)[1,10]。本研究中5 種植物在“魚-植物”共生模式下根系細(xì)菌OTU 結(jié)果看，絕大部分為特有類型，彼此間差異極大，進一步證實了上述結(jié)論。

3.2 根系細(xì)菌促進氮磷利用

植物對不同化合態(tài)的N、P 的吸收利用效率差異極大，對氮的利用主要為銨態(tài)氮和硝態(tài)氮，對磷的利用主要是處于溶解態(tài)的有機或無機磷[11,12]。在“魚-植物”共生模式下，水體中的P 濃度含量較低，植物根系微生物通過生理生化途徑提供可溶態(tài)磷以滿足植物生長發(fā)育所需。現(xiàn)有證據(jù)表明，巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、歐文氏菌屬（Ewingella）等根系細(xì)菌能夠參與相關(guān)生理活動，而且在根系中的真菌，尤其是叢枝菌根真菌在提升磷的利用效率中作用更為顯著[13,14]；不同植物對P 的利用效率有較大差異，相比燈心草（Juncus effusus L.）和蝴蝶花（Iris japonica Thunb.），石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott）吸收同化磷素的效率更高[15]。這種差異可能與根系中與磷利用相關(guān)菌群數(shù)量有關(guān)，并已在水芹菜的研究中獲得了證實[16]。與P 利用相比，植物對N 的利用表現(xiàn)出更為復(fù)雜的生理生化特性；就參與N 利用的根系微生物而言，涉及氨氧化細(xì)菌、亞硝酸鹽氧化細(xì)菌和其他消化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌、根瘤菌乃至部分真菌，但細(xì)菌在植物對N 的吸收利用中起著主要作用[1,16]。同樣，不同植物中與N 利用相關(guān)的菌群存在著巨大差異，例如，蘆葦根際比香蒲更適合亞硝酸細(xì)菌的生長[17]。在逆境條件下，植物根系細(xì)菌群落有較高的固氮和解磷等促生能力[9]，而在“魚-植物”這一種養(yǎng)模式下，水稻根系中存在與氮代謝如固氮、硝化、反硝化及除磷、降解纖維素、降解各類有機物、吸收金屬離子、產(chǎn)生絮凝劑等作用的細(xì)菌[18]，這與本研究所得到的結(jié)果一致，并且這些菌群在促進植物營養(yǎng)元素吸收中具有潛在的利用價值，相關(guān)研究已在種植業(yè)中開展了廣泛研究并在土塘改良[19]、肥力提升[20]中取得了良好效果。

3.3 結(jié)論

“魚-植物”共生模式下，不同種類植物根系細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異極大，這種差異與植物對營養(yǎng)元素的吸收及利用密切相關(guān)，且不同植物對各類營養(yǎng)元素的吸收及利用也存在巨大差異。鑒于此，為了提高共生植物對水產(chǎn)養(yǎng)殖中水或尾水的凈化效率，建議在選擇該技術(shù)時應(yīng)采用多種植物搭配模式。