西藏土壤芽孢桿菌的分離鑒定及生防促生菌篩選

董曉雪 彭國袁 常卓凡 于文娟 旺姆

摘要：青稞是西藏人民的主要糧食作物，在種植生長過程中有多種病害對其產生危害，直接影響青稞的產量和質量。本研究針對如何綠色防治西藏青稞網斑病立題，以期找到對某一種或幾種青稞病害高效的生防菌株，為青稞網斑病防治及生產實際提供材料。采集林芝市魯朗鎮扎西崗村的青稞網斑病植株活體樣本，采用組織分離法和離體培養法獲得青稞網斑菌菌株XZQKWB。從西藏自治區不同采樣點采集根際土壤，采用溫度篩選法和平板涂布法分離得到11 718株芽孢桿菌。以分離得到的芽孢桿菌為材料，以6種病原菌為靶標，共篩選得到 14 株對 6 種病原菌均具有不同程度的抑制效果的芽孢桿菌：91-5、92-1、92-10、92-3、27-36、32-69、94-19、44-36、5-142、58-59、58-7、59-60、63-35和 66-53。結合形態特征、生理生化特征、16S rDNA 序列分析，初步鑒定 58-7、59-60、27-36、63-35、44-36、58-59 和66-53 為阿氏芽孢桿菌（Priestia aryabhattai）；菌株 94-19 和 32-69 為沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）；菌株 92-10 和 92-3 為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）；菌株 91-5 為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）；菌株 92-1和 5-142 為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。對14株菌進行生防盆栽和促生盆栽試驗，結果表明菌株 92-10 兼具溶無機磷能力、解鉀能力、固氮能力等促生特性，對藏青 2000 種子的根長、芽長、株高、地上部鮮質量都有明顯的促生效果，在平皿對峙試驗中對6個病原菌的抑制率均達到50%以上，在青稞網斑病的盆栽防治試驗中防效達到 76.5%。

關鍵詞：芽孢桿菌；分離；鑒定；生防促生；青稞網斑病

中圖分類號：S182? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）23-0114-10

青稞（Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. f.）是禾本科大麥屬的一種禾谷類作物，因成熟時籽粒裸露別稱裸大麥，主要分布在青海、西藏以及甘肅等高海拔地區，其中以西藏種植范圍最廣［1］。公元5世紀以來，青稞是藏族同胞的主糧，在青藏高原被廣泛種植，不僅為藏區的糧食安全提供了重要保障，而且為釀造行業提供了優良原料，其中青稞酒和青稞啤酒深受人們的喜愛［2］。 青稞網斑病是西藏自治區青稞種植上最常見的重要病害之一，是一種分布廣且危害重的種傳病害，發病嚴重時植株死亡率可達 9%～40%，嚴重影響產量和品質［3］。青稞網斑病病原菌為子囊菌亞門、核腔菌屬，無性時期為半知菌亞門、長蠕孢屬的大麥網斑內臍蠕孢［Drechslera teres （Sacc.） Shoem.］，有性態為子囊菌綱、盤菌目、盤菌科、核腔菌屬的圓核腔菌［Pyrenophora teres （Died.） Drechler］［4］。目前青稞網斑病的防治方法仍以使用化學試劑為主，但長期使用化學試劑會影響青稞的品質，并且對人畜和生態環境也有巨大的威脅。生防菌綠色、安全且無公害，可以改善作物環境，調節土壤的理化性質，具有很大的發展潛力。生物防治是一種環境友好型策略，經過多年來科研工作者的共同努力，篩選到了大量菌株，近年來用于防治植物病害的生防菌中芽孢桿菌是應用最廣泛的菌種之一，芽孢桿菌繁殖快、抗逆性強、生物安全性高，可以通過拮抗作用、競爭作用及誘導植物產生抗性等機制防治植物病害病原菌。多個試驗研究表明，芽孢桿菌屬中的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）、多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）、巨大芽孢桿菌（B. megaterium）和短小芽孢桿菌（B. pumilus）可以防治各類作物病害，是重要的生防菌來源［5-9］。芽孢桿菌作為一種非致病細菌，安全、綠色，可以高效拮抗病原微生物。本研究從西藏不同生態區根際土壤中篩選能抑制青稞網斑病和小麥赤霉病的拮抗細菌及能溶磷、解鉀固氮、產吲哚-3-乙酸（IAA）的促生細菌，研究其防病促生效果，以期為青稞生產上的病害防控以及產量提高提供有效途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗時間及地點

試驗時間為2021年12月至2023年3月。試驗地點為西藏農牧學院植物科學學院植物病理與微生物實驗室。

1.2 供試材料

1.2.1 供試土壤 采自西藏自治區不同生態區的根際土壤。

1.2.2 供試病原真菌 青稞網斑病菌［Pyrenophora teres （Died.） Drechler］從采集的病部樣本中分離。禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、蘋果腐爛病菌（Valsa mali）、辣椒枯萎病菌（F. oxysporum）、黃瓜立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）、亞洲鐮刀菌（F. asiaticum），由西藏農牧學院植物病理與微生物實驗室提供。

1.2.3 供試培養基

試驗主要培養基有馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基、羧甲基纖維素鈉（CMC）培養基、LB培養基、無機磷培養基、亞力山德羅夫培養基、Ashby培養基、King 氏液體培養基［10-16］。

1.2.4 供試青稞種子 試驗用青稞種子為藏青2000。

1.3 青稞網斑病病原菌的分離鑒定

1.3.1 分離

青稞網斑病病株材料選自西藏自治區林芝市魯朗鎮扎西崗村（94°74′E，29°74′N），海拔 3 373 m。采用組織分離法分離青稞網斑病病原菌，將處理好的葉片放在 PDA 培養基中，用封口膜封好，在25 ℃培養箱中培養7 d。用接種針挑取邊緣部位，接種到新的PDA培養基中，共純化3次。純化后用5 mm打孔器打孔，將菌餅倒置于空白的PDA培養基中，培養7 d。

1.3.2 鑒定

在顯微鏡下觀察病原菌的孢子及菌絲形態，并將 PCR 產物送至北京擎科生物科技股份有限公司進行后續ITS鑒定。將測定序列在 NCBI 網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）上進行同源性比較（BLAST），選取其中與之同源性較高的細菌ITS序列，利用 MEGA軟件進行序列對比及剪裁，用NJ（neighbor-joining）法構建系統發育樹。

1.4 西藏土樣芽孢桿菌的分離、純化及保藏

本試驗自西藏自治區不同生態區采集到97份根際土壤，采用平板涂布法，對土壤里的芽孢桿菌進行分離及純化，得到11 718株菌，對分離得到的菌株進行保藏。

1.5 生防芽孢桿菌的篩選

采用平板對峙法分別測定所有菌株對青稞網斑病菌、禾谷鐮刀菌、蘋果腐爛病菌、辣椒枯萎病菌、黃瓜立枯絲核菌、亞洲鐮刀菌的抑菌活性。

1.5.1 初篩

用5 mm打孔器在病原菌的平板上打孔制成菌餅，再用接種針挑取菌餅接種于PDA平板中央，將待測芽孢桿菌等距接于病原菌的四周，四周的芽孢桿菌為不同的菌株，將接種好的平板培養基用封口膜封口并倒扣置于25 ℃恒溫培養箱培養4～7 d后觀察。篩選對指示菌有明顯抑菌活性（抑菌帶或抑菌圈）的菌株。

1.5.2 復篩

采用平板對峙的方式，用接種針挑取 PDA 平板的病原菌菌餅，倒置接種于 PDA 培養基中央，用直徑 5 mm 無菌打孔器將病原菌制成菌餅，再用接種針挑取菌餅接種于PDA 平板中央，將待測芽孢桿菌等距接于病原菌的四周，對初篩入選的每個芽孢桿菌形成1組，每組重復 3 次，在 25 ℃恒溫培養箱繼續培養 3 d。用十字交叉法測量抑菌圈的直徑，列表記錄。抑菌率=（對照真菌菌落直徑-處理真菌菌落直徑）/對照真菌菌落直徑×100%。將抑菌率數據列表記錄。

1.6 生防芽孢桿菌的鑒定

1.6.1 形態學鑒定

將篩選得到的14株具有拮抗效果的菌株接種于LB固體培養基上，培養48 h后觀察菌落的形態特征，確定菌株的形態，進行革蘭氏染色后觀察菌株細胞的形態及產孢情況［17］。

1.6.2 生理生化特征

參照《常見細菌系統鑒定手冊》中的方法對14株菌株進行接觸酶試驗、V-P試驗、甲基紅試驗、脲酶水解試驗、淀粉水解試驗、吲哚試驗、糖醇類發酵試驗（葡萄糖、甘露醇、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、半乳糖、肌醇）［18］。

1.6.3 分子生物學鑒定

將14株菌株的平板送至北京擎科生物科技股份有限公司進行16S rDNA鑒定，將測定序列在NCBI網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）上進行同源性比較（BLAST），選取其中與之同源性較高的細菌16S rDNA序列，利用MEGA軟件進行序列對比及剪裁，用NJ法構建系統發育樹。

1.7 芽孢桿菌的促生效果驗證

1.7.1 溶無機磷能力的測定

將無機磷培養基制成平板，將菌株點接于平板的四周，設置不加菌株的空白培養基為對照，在 28 ℃培養 5～7 d 后觀測溶磷效果［19］。采用十字交叉法測量溶磷圈直徑（D）及菌落直徑（d），D/d的數值越大，說明溶無機磷磷效果越好。

1.7.2 解鉀能力的測定

將亞歷山德羅夫培養基制成平板，將菌株點接于平板四周，設置不加菌株空白培養基為對照，在 28 ℃培養 5～7 d 后觀測解鉀效果［20］。采用十字交叉法測量解鉀圈直徑（D）及菌落直徑（d），D/d數值越大，說明解鉀效果越好。

1.7.3 固氮能力的測定

采用劃線接種的方法，將菌株劃線于Ashby固體培養基上，在30 ℃培養 10 d，連續轉接3次，第3次依然能在Ashby培養基上生長的細菌則被視為具有固氮能力［21］。

1.7.4 產IAA能力的測定

將14株菌株接種到LB液體培養基中，置于28 ℃且180 r/min的搖床培養24 h，取菌懸液測D600 nm為 0.5 左右。將菌懸液接種到含100 mg/L的King氏液體培養基中和不含色氨酸的King氏液體培養基中，設置空白的無菌水作為對照組，置于28 ℃且180 r/min的搖床培養 5 d。取一定量的菌懸液加入等量的PC比色液或S2比色液滴在白瓷版上，觀察顏色變化，顏色變粉或變紅，說明具有產IAA能力，顏色越紅代表產 IAA 能力越強［22］。

1.7.5 促生功能驗證

將14株菌株接種到LB液體培養基中，置于28 ℃且180 r/min的搖床培養 24 h，取菌懸液稀釋50、500倍。提前將種子用75%乙醇和5%次氯酸鈉進行消毒處理，然后將種子分別用14株菌株的50、500倍菌懸液浸種2 h，對照組用清水浸種2 h，隨后分別整齊擺放在滅菌的培養皿中。用于平皿試驗的種子，每個處理3次重復，每次重復10粒青稞種子，設置清水對照，加入適量無菌水放入25 ℃恒溫培養箱培養7 d，測量其芽長和根長。用于促生盆栽的種子，放入適量無菌水催芽 12 h。每個處理3次重復，每次重復10粒青稞種子，設置清水對照。

1.8 芽孢桿菌的生防效果驗證

將培養7 d的青稞網斑病病原菌菌株和小麥赤霉病病原菌菌株接種到滅菌的CMC培養基中，25 ℃、200 r/min條件下培養5～7 d后用紗布過濾得到孢子懸液，用血球計數板計數，然后配制成濃度為106 CFU/mL的孢子懸液。將14株菌株接種到LB液體培養基中，置于28 ℃且180 r/min的搖床培養24 h，取菌懸液稀釋50、500倍。提前將種子用75%乙醇和5%次氯酸鈉進行消毒處理，然后將種子分別用14株菌株的50、500倍菌懸液浸種 2 h，對照組用清水浸種2 h，隨后在青稞網斑病菌孢子懸浮液中浸種30 min，放入適量無菌水催芽 12 h。每個處理3次重復，每次重復10粒青稞種子，設置清水對照。青稞網斑病防治盆栽培養7 d后，按嚴重度分級標準計算各處理與對照的病情指數及防效［23］。

2 結果與分析

2.1 青稞網斑病病原菌的分離及鑒定

對分離得到的青稞網斑病病原菌XZQKWB的菌落形態進行觀察，可以看出菌落中間為墨綠色，大體呈灰色，圓形，絮狀，微微凸起于培養基的表面（圖1）。將該菌株的ITS序列在NCBI網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）上進行同源性比較（BLAST），選取其中與之同源性較高的真菌ITS rDNA 序列，利用MEGA軟件進行序列對比及剪裁，用NJ法構建系統發育樹。發現該菌的ITS與圓核腔菌（Pyrenophora teres）高度相似，達99%以上，其中與Pyrenophora teres isolate 98-2a的同源性達100%（圖2）。

2.2 生防芽孢桿菌的篩選

初篩獲得825 株菌株能對6種靶標病原菌具有不同程度的抑制作用，其中大部分菌株的抑制率為10%～20%，有56株菌株對部分病原菌的抑制率可達到50%及以上。采用平板對峙法，對初篩入選的56株菌株進行復篩，篩選出具有較好拮抗效果的菌株14株，14株菌株對6種靶標病原菌的抑制率如表1所示。

2.3 生防芽孢桿菌的鑒定

2.3.1 形態鑒定

將菌株接種于LB培養基上，25 ℃ 恒溫培養48 h后，觀察平板中的菌落形態，菌株的顏色為白色和褐色，形狀多為圓形，表面多為光滑、濕潤、不平坦和不透明，邊緣整齊或不整齊（表2）。

2.3.2 生理生化試驗 14株菌株的革蘭氏染色試驗結果表明，14株菌株均為陽性，個體形態多為桿狀，單個或成鏈狀。14株菌株的生理生化試驗結果如表3所示。

2.3.3 分子生物學鑒定

將篩選得到的具有拮抗效果的 14株菌株進行 16S rDNA 序列測定，并在 NCBI 數據庫進行 BLAST同源性比對，比對結果如圖3 所示。

結合形態特征、生理生化特征、16S rDNA 序列分析， 推斷 58-7、59-60、27-36、63-35、44-36、58-59和66-53為阿氏芽孢桿菌；菌株94-19和32-69為沙福芽孢桿菌；菌株 92-10和92-3為萎縮芽孢桿菌；菌株 91-5 為貝萊斯芽孢桿菌；菌株92-1和5-142為枯草芽孢桿菌。

2.4 芽孢桿菌的促生效果驗證

2.4.1 溶無機磷能力的測定

由表4可知，對14株芽孢桿菌進行溶無機磷能力測定，結果表明14株菌株均具有溶無機磷能力，能力最強的菌株是32-69、44-36和27-36。

2.4.2 解鉀能力的測定

由表5可知，對14株芽孢桿菌進行解鉀能力測定，結果表明，12株菌株具有解鉀能力，能力最強的2個菌株是44-36和 63-35。

2.4.3 固氮能力的測定

對14株芽孢桿菌進行固氮能力測定，結果（圖4）表明，14株菌株均具有固氮能力。

2.4.4 產IAA能力的測定

由圖5、表6可知，對14株芽孢桿菌進行產IAA能力測定，結果表明，13株菌株具有產IAA能力。

2.4.5 平皿試驗

由表7可知，處理過的植株與對照組相比具有顯著差異。從芽長和根長方面來看，經過50倍菌液處理過的種子在平皿上的生長情況比對照組的生長情況相對較好。從根長方面來看，處理組的植株與對比組的植株存在顯著差異，菌株

63-35、27-36、92-10 菌液處理過的植株根長促生效果較好；從芽長方面來說，菌株92-10、92-1 和92-3菌液處理過的植株芽長促生效果較好。

從芽長和根長方面來看，經過500倍菌液處理過的種子在平皿上的生長情況比對照組的生長情況相對較好。從根長方面來看，處理組的植株與對照組的植株存在顯著差異，菌株63-35、44-36、94-19 菌液處理過的植株芽長促生效果較好；從芽長方面來說，菌株44-36、94-19、63-65菌液處理過的植株芽長促生效果較好。

2.4.6 促生盆栽

由表8可知，50倍菌液處理過的植株與對照組相比具有顯著差異。從根長方面來看，處理組植株與對照組植株差異不顯著；從株高方面來說，菌株 58-7、92-1、91-5菌液處理過的植株株高促生效果較好。從地上部鮮質量方面來看，菌株92-3、58-59、59-60菌液處理過的植株地上部鮮質量促生效果較好；從地上部干質量方面來說，經過菌株92-3、58-59和59-60菌液處理過的植株地上部干質量促生效果較好。從地下部鮮質量方面來看，處理組植株與對照組植株差異不顯著，經過菌株27-36菌液處理的種子生長情況相較對照組種子生長情況較差，經過菌株92-3、59-60、63-35菌液處理過的植株地下部鮮質量促生效果較好；從地下部干質量方面來說，菌株58-59、59-60和92-3 菌液處理過的植株地下部干質量促生效果較好。

由表9可知，500倍菌液處理過的植株與對照組相比，差異不顯著。

2.4.7 生防盆栽 由表10可知，50倍菌液處理對青稞網斑的防治試驗，菌株92-10的病情指數為20.99，相對防效為76.50%；菌株58-59的病情指數為22.51，相對防效為74.79；菌株94-19的病情指數為34.61，相對防效為61.24%。500倍菌液處理對青稞網斑的防治試驗，菌株58-59的病情指數為25.40，相對防效為71.56%；菌株94-19的病情指數為28.33，相對防效為68.27；菌株59-60的病情指數為33.34，相對防效為62.67%。

3 討論

Bhattacharyya等的研究表明，茶樹根際土壤的阿氏芽孢桿菌 AB211可溶解無機磷酸鹽，合成鐵載體，并具有產IAA能力［24］。阿氏芽孢桿菌菌株 59-60、27-36、63-35、44-36、58-59和66-53均兼具融磷、解鉀、固氮和產IAA能力，且對青稞具有一定的促生效果，對青稞網斑病具有較好的防治效果。Rong等研究表明，從桂花中分離出的沙福芽孢桿菌對水稻稻瘟病有生防潛力［25］。本研究中沙福芽孢桿菌菌株94-19兼具溶磷、固氮和產IAA能力，菌株32-69兼具溶磷、解鉀、固氮和產IAA能力，菌株94-19和菌株32-69對青稞的根長、芽長、株高均具有良好的促生效果，且對青稞網斑病的防治效果達到68.27%和47.74%。劉欣等從草原土樣中分離得到1株萎縮芽孢桿菌DM3-18，對蘋果樹腐爛病的防治效果高達77%以上且對其他 9 種病原菌均具有一定的拮抗效果［26］。本研究中萎縮芽孢桿菌菌株92-10兼具溶磷、解鉀和固氮能力，菌株92-3兼具溶磷、解鉀、固氮和產IAA能力，2個菌株對根長、株高都具有較好的促生效果，且對青稞網斑病的防治效果達到76.5%、50.65%。劉子瑤等從人參根部分離得到貝萊斯芽孢桿菌 LXS-N2，對人參立枯病病原菌和人參猝倒病病原菌的抑菌率達到70.27%、78.30%，具有較好的生防潛力［27］。本研究中貝萊斯芽孢桿菌91-5兼具溶磷、解鉀、固氮和產IAA能力，對青稞的芽長、根長和株高具有一定的促生效果，對青稞網斑病的防效為42.40%。敖遠等對枯草芽孢桿菌262XY2的試驗表明，0.5%菌肥處理對番茄促生效果最好［28］。

祖雪等從健康葉片中分離得到枯草芽孢桿菌K-268，對稻瘟病病菌的抑制率為86.30%，對稻瘟病的防效達到60.23%［29］。本研究中枯草芽孢桿菌菌株92-1和5-142兼具溶磷、解鉀、固氮和產IAA能力，對青稞具有一定的促生效果，對青稞網斑病的盆栽防效為58.34% 和45.85%。

由于土壤中分離得到的芽孢桿菌屬在生物防治以及植株促生方面的研究越來越多，尋找新的具有生防潛力和促生潛力的菌株并對其開發利用是近幾年的熱點之一。本研究采集了不同生境的土壤，對其中的芽孢桿菌進行研究，篩選得到具有生防和促生功能的菌株，對青稞的種植以及生物防治具有重要的意義。但試驗只做到了室內盆栽部分，還沒有進行大田試驗驗證，前人研究中生防菌株都存在平皿試驗和室內盆栽試驗效果較好，但在大田試驗中防效較差，且促生效果也較差，存在抑菌效果不穩定的缺陷。

總之，分離篩選得到的菌株具有一定的生防潛力，不僅為青稞網斑病的防治研究提供了一定的基礎，對其他病害的防治也有一定的參考效果。

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