消巖湯干預(yù)Beclin1-YAP1環(huán)路逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥研究

楊佩穎，劉宏根，賈英杰

消巖湯干預(yù)Beclin1-YAP1環(huán)路逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥研究

楊佩穎，劉宏根，賈英杰

天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，國(guó)家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300381

探討消巖湯逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥的具體分子機(jī)制。高表達(dá)Beclin1肺腺癌耐藥（lung adenocarcinoma drug-resistant，A549/DDP）、低表達(dá)Beclin1 A549/DDP、高表達(dá)Yes關(guān)聯(lián)蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）A549/DDP和低表達(dá)YAP1 A549/DDP細(xì)胞分別給予消巖湯和順鉑干預(yù)，采用Transwell和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲和增殖；采用Western blotting檢測(cè)Beclin1、YAP1、P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、肺耐藥相關(guān)蛋白（lung resistance-related protein，LRP）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ）、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3，p-STAT3）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）表達(dá)。BALB/c小鼠sc高表達(dá)Beclin1 A549/DDP、低表達(dá)Beclin1 A549/DDP、高表達(dá)YAP1 A549/DDP和低表達(dá)YAP1 A549/DDP細(xì)胞建立移植瘤模型，ig消巖湯和瘤內(nèi)注射順鉑治療14 d，采用免疫組化檢測(cè)腫瘤Beclin1、YAP1、P-gp和LRP蛋白表達(dá)。消巖湯聯(lián)合順鉑作用于高表達(dá)Beclin1和高表達(dá)YAP1肺癌細(xì)胞株，細(xì)胞侵襲和增殖能力增強(qiáng)（＜0.05），而低表達(dá)Beclin1和低表達(dá)YAP1肺癌細(xì)胞株，肺癌耐藥細(xì)胞株侵襲和增殖能力減弱（＜0.05）；低表達(dá)Beclin1肺癌細(xì)胞株Beclin1、YAP1、P-gp和LRP蛋白表達(dá)水平均明顯降低（＜0.05）；高表達(dá)Beclin1肺癌細(xì)胞株Beclin1、YAP1、P-gp和LRP蛋白表達(dá)水平均明顯升高（＜0.05）；低表達(dá)YAP1肺癌細(xì)胞株p-STAT3、TAZ、Beclin1、YAP1、P-gp和LRP蛋白表達(dá)水平均明顯降低（＜0.05）；高表達(dá)YAP1肺癌細(xì)胞株TAZ、Beclin1、YAP1和P-gp蛋白表達(dá)水平均明顯升高（＜0.05）。小鼠移植瘤模型中，高表達(dá)Beclin1組和高表達(dá)YAP1組瘤體大于對(duì)照組，而低表達(dá)Beclin1組和低表達(dá)YAP1組瘤體小于對(duì)照組。消巖湯通過Beclin1直接影響YAP1表達(dá)，消巖湯又可通過YAP1-TAZ通路影響B(tài)eclin1表達(dá)，消巖湯可能通過干預(yù)Beclin1-YAP1環(huán)路逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥。

消巖湯；肺癌；順鉑；耐藥；Beclin1；YAP1

肺癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，化療是晚期肺癌患者有效的治療方法之一[1]。然而在肺癌的化療過程中，容易出現(xiàn)耐藥，這將意味著腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性下降，化療藥物作用減弱，影響患者治療效果[2]。因此亟需探究化療耐藥機(jī)制。自噬對(duì)于組織細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞的代謝需求及細(xì)胞器的更新有著重要意義，自噬與化療耐藥密切相關(guān)[3]。Beclin1作為自噬啟動(dòng)過程的標(biāo)志，與順鉑耐藥密切相關(guān)[4]，研究認(rèn)為Beclin1可作為逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥的靶點(diǎn)[5]。天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑消巖湯臨床應(yīng)用多年，配合放化療在穩(wěn)定患者腫瘤病灶等方面均有良好療效，同時(shí)在改善證候和改善化療的不良反應(yīng)等方面也有較好的作用[6]。前期課題組發(fā)現(xiàn)消巖湯能夠增加肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥，其機(jī)制可能與Beclin1和Yes關(guān)聯(lián)蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）相關(guān)[7]，然而其具體分子靶點(diǎn)尚不清晰。因此在前期研究基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探討消巖湯改善肺癌耐藥細(xì)胞株對(duì)順鉑敏感性、逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠25只，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號(hào)110322220102626561，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0008。動(dòng)物于相對(duì)濕度50%～60%、室溫（25±2）℃的SPF級(jí)動(dòng)物屏障房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，每籠5只，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)決議批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)IRM-DWLL-2022185）。

1.2 細(xì)胞

A549/DDP細(xì)胞購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司；高表達(dá)Beclin1 A549/DDP（簡(jiǎn)稱Ad-Beclin1）、低表達(dá)Beclin1 A549/DDP（簡(jiǎn)稱Si-Beclin1）、高表達(dá)YAP1 A549/DDP（簡(jiǎn)稱Ad-YAP1）和低表達(dá)YAP1 A549/DDP（簡(jiǎn)稱Si-YAP1）細(xì)胞由天津時(shí)域科技有限公司設(shè)計(jì)并獲得穩(wěn)定表達(dá)。

1.3 藥材

消巖湯由黃芪30 g、太子參15 g、郁金10 g、姜黃10 g、夏枯草15 g、白花蛇舌草15 g、生牡蠣30 g、蜂房15 g組成。實(shí)驗(yàn)所用中藥藥材均購(gòu)自北京盛世龍中藥飲片有限公司，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)賈英杰教授鑒定，黃芪為豆科植物蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao的干燥根、太子參為石竹科植物孩兒參(Miq.) Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根、郁金為姜科植物溫郁金Y. H. Chen et C. Ling的干燥塊根、姜黃為姜科植物姜黃L.的干燥根莖、夏枯草為唇形科植物夏枯草L.的干燥果穗、白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草(Willd.) Roxb.的全草、生牡蠣為牡蠣科動(dòng)物長(zhǎng)牡蠣Thunberg的貝殼、蜂房為胡蜂科昆蟲果馬蜂(DeGeer)的干燥巢。

1.4 藥品與試劑

順鉑（國(guó)藥準(zhǔn)字H37021358）購(gòu)自齊魯制藥有限公司；10%胎牛血清（批號(hào)10270106）、RPMI 1640培養(yǎng)基（批號(hào)C11875500BT）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；1%青霉素-鏈霉素（批號(hào)P1400）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Beclin1抗體（批號(hào)ab210498）、YAP1抗體（批號(hào)ab76252）、P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）抗體（批號(hào)ab103477）、肺耐藥相關(guān)蛋白（lung resistance-related protein，LRP）抗體（批號(hào)ab92544）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)ab8245）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ）抗體（批號(hào)ab242313）、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3，p-STAT3）抗體（批號(hào)ab68153）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抗體（批號(hào)ab134903）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.5 儀器

IX53型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；HSY-28型恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；680型全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀、Powerpac Basic電泳儀、小型垂直電泳槽、ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；Alpha Imager EC凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Alpha Innotech公司）；New Brunswich Innova 2100型恒溫?fù)u床（德國(guó)Eppendorf公司）；HB2448K型無菌操作臺(tái)（丹麥Holten laminair公司）；TD5Z型低速水平離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 消巖湯的制備

消巖湯于天津中醫(yī)藥大學(xué)炮制實(shí)驗(yàn)室制備，取消巖湯全方140 g，其中黃芪30 g、太子參15 g、郁金10 g、姜黃10 g、夏枯草15 g、白花蛇舌草15 g、生牡蠣30 g、蜂房15 g，混勻，加入10倍量蒸餾水，浸泡45 min，煮沸45 min，濾過；濾渣加入8倍量蒸餾水，煮沸30 min，濾過，合并2次濾液，蒸餾濃縮，置70～80 ℃水浴中濃縮至300 mL，濃縮液為棕黃色液體，生藥量為2.9 g/mL，冷卻裝入滅菌藥瓶，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 體外實(shí)驗(yàn)

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 所有細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2.2 Transwell實(shí)驗(yàn) 設(shè)置對(duì)照組、Ad-Beclin1組、Si-Beclin1、Ad-YAP1和Si-YAP15組，Ad5/dE1A感染細(xì)胞24 h后，收集各組細(xì)胞，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，接種至Transwell小室內(nèi)（5×103個(gè)/孔），Transwell下室加入含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每組加入消巖湯30 mg/mL和順鉑（80 μmol/mL）[7]，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h。取出Transwell小室，用棉簽拭去膜上層未遷移的細(xì)胞，70%甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色10 min。于顯微鏡下拍照并統(tǒng)計(jì)膜背面上的細(xì)胞數(shù)。

2.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn) 設(shè)置對(duì)照組、Ad-Beclin1組、Si-Beclin1、Ad-YAP1和Si-YAP15組，Ad5/dE1A感染細(xì)胞24 h后，收集各組細(xì)胞，以400個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)10～14 d，直到大多數(shù)單個(gè)細(xì)胞集落含有50個(gè)細(xì)胞以上時(shí)停止培養(yǎng)。以4%多聚甲醛固定細(xì)胞后，加入0.1%結(jié)晶紫溶液染色，拍照并計(jì)數(shù)。

2.2.4 Western blotting實(shí)驗(yàn) 設(shè)置對(duì)照組、Ad-Beclin1組、Si-Beclin1、Ad-YAP1和Si-YAP1 5組，Ad5/dE1A感染細(xì)胞24 h后，收集各組細(xì)胞，以1×106個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，提取蛋白。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中封閉60 min，分別加入Beclin1、YAP1、P-gp、LRP、TAZ、p-STAT3、mTOR和GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次，每次10 min，加入二抗，室溫孵育60 min；TBST洗滌3次，每次10 min，加入ECL發(fā)光試劑顯影。

2.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

將25只BALB/c小鼠按照隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為對(duì)照組、Ad-Beclin1組、Si-Beclin1、Ad-YAP1和Si-YAP1 5組，每組5只。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ad-Beclin1、Si-Beclin1、Ad-YAP1和Si-YAP15細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，PBS洗滌2次，1000 r/min離心5 min，棄上清，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞密度為5×10個(gè)/mL，5組小鼠右前腋下接種0.2 mL相應(yīng)細(xì)胞，待小鼠皮下腫瘤的平均直徑達(dá)到5 mm時(shí)開始給藥，小鼠ig 0.2 mL 2.9 g/mL消巖湯（28.7 mg/g），2次/d，并瘤內(nèi)注射順鉑（2 mg/kg），1次/d，連續(xù)給14 d[8]。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與處理，兩樣本均數(shù)的比較選擇檢驗(yàn)，多組樣本均數(shù)的比較應(yīng)用方差分析。

3 結(jié)果

3.1 消巖湯聯(lián)合順鉑對(duì)不同蛋白表達(dá)的A549/DDP細(xì)胞侵襲和增殖的影響

如圖1-A、B所示，與對(duì)照組比較，Ad-Beclin1組和Ad-YAP1組細(xì)胞侵襲數(shù)均明顯增多（＜0.05），Si-Beclin1組和Si-YAP1組細(xì)胞侵襲數(shù)均明顯減少（＜0.05）。

如圖1-C、D所示，與對(duì)照組比較，Ad-Beclin1組和Ad-YAP1組細(xì)胞克隆數(shù)均明顯增多（＜0.05），Si-Beclin1組和Si-YAP1組細(xì)胞克隆數(shù)均明顯減少（＜0.05）。

3.2 消巖湯聯(lián)合順鉑對(duì)不同蛋白表達(dá)的A549/DDP細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，Si-Beclin1組Beclin1、YAP1、P-gp和LRP蛋白表達(dá)水平均明顯降低（＜0.05）；Ad-Beclin1組Beclin1、YAP1、P-gp和LRP蛋白表達(dá)水平均明顯升高（＜0.05）；Si-YAP1組p-STAT3、TAZ、Beclin1、YAP1、P-gp和LRP蛋白表達(dá)水平均明顯降低（＜0.05）；Ad-YAP1組TAZ、Beclin1、YAP1和P-gp蛋白表達(dá)水平均明顯升高（＜0.05）。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05，下圖同

圖2 消巖湯聯(lián)合順鉑對(duì)不同蛋白表達(dá)的A549/DDP細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

3.3 消巖湯聯(lián)合順鉑對(duì)移植瘤小鼠的影響

如圖3所示，Ad-Beclin1組和Ad-YAP1組腫瘤體積明顯大于對(duì)照組（＜0.05），Si-Beclin1組和Si-YAP1組腫瘤體積明顯小于對(duì)照組（＜0.05）。

圖3 消巖湯聯(lián)合順鉑對(duì)移植瘤小鼠腫瘤體積的影響(, n = 5)

4 討論

腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥是一個(gè)多因素、多步驟的過程，目前對(duì)于肺癌順鉑耐藥機(jī)制尚無統(tǒng)一認(rèn)識(shí)[9]。研究發(fā)現(xiàn)自噬在腫瘤化療過程中起重要作用，化療藥物處理的腫瘤細(xì)胞可發(fā)生死亡性自噬和保護(hù)性自噬。當(dāng)機(jī)體處于病理狀態(tài)時(shí)，自噬可以作為一種能量的來源為機(jī)體提供能量，因此自噬對(duì)癌細(xì)胞的化療耐藥起到保護(hù)的作用，通過干預(yù)細(xì)胞自噬可作為逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥的一種新的治療方法[10]。Beclin1是自噬啟動(dòng)過程的標(biāo)志，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Beclin1與化療藥物耐藥密切相關(guān)[11]。在卵巢癌中，改變Beclin1的表達(dá)可以增強(qiáng)凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)而提高耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[11]。Beclin1可激活YAP1蛋白，共同促進(jìn)耐藥的發(fā)生[13]。YAP1在調(diào)節(jié)組織穩(wěn)態(tài)、器官體積、再生及腫瘤形成中發(fā)揮重要作用，YAP可通過激活生長(zhǎng)因子信號(hào)、抑制凋亡、調(diào)節(jié)DNA損傷反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)干細(xì)胞樣特性、誘導(dǎo)間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，引起抗腫瘤治療過程中的耐藥作用[14]。目前常見逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物往往對(duì)人體產(chǎn)生很強(qiáng)的心血管、肝、腎毒性或免疫抑制等不良反應(yīng)，從中藥中尋找理想的耐藥逆轉(zhuǎn)劑有著廣闊的前景。賈英杰教授根據(jù)多年腫瘤臨床經(jīng)驗(yàn)并結(jié)合中醫(yī)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論，認(rèn)為肺癌發(fā)病病機(jī)為正氣內(nèi)虛，邪留毒聚，瘀毒并存；在此基礎(chǔ)上根據(jù)中藥功效及現(xiàn)代藥理研究擬定消巖湯[15]。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)消巖湯能夠抑制肺癌耐藥細(xì)胞株增殖及侵襲，提示消巖湯能夠改善肺癌順鉑耐藥細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)耐藥；此外，順鉑聯(lián)合消巖湯可能調(diào)控自噬相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)而逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥，其靶點(diǎn)可能與Beclin1和YAP1相關(guān)[7]。然而消巖湯作用靶點(diǎn)目前尚未清晰，因此本研究通過細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討消巖湯逆轉(zhuǎn)化療耐藥的分子機(jī)制。

首先，通過Transwell和克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察消巖湯聯(lián)合順鉑干預(yù)不同蛋白表達(dá)下A549/DDP細(xì)胞增殖和侵襲情況，結(jié)果顯示，消巖湯聯(lián)合順鉑作用于高表達(dá)Beclin1和高表達(dá)YAP1肺癌細(xì)胞株，細(xì)胞侵襲和增殖能力增強(qiáng)；而作用于低表達(dá)Beclin1和低表達(dá)YAP1肺癌細(xì)胞株，肺癌耐藥細(xì)胞株侵襲和增殖能力減弱。初步證實(shí)消巖湯聯(lián)合順鉑逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥分子通路可能與Beclin1和YAP1相關(guān)，與前期研究結(jié)果一致[7]。進(jìn)一步通過檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，消巖湯聯(lián)合順鉑干預(yù)高表達(dá)Beclin1耐藥細(xì)胞株和低表達(dá)Beclin1耐藥細(xì)胞株，YAP1、P-gp和LRP和Beclin1的變化趨勢(shì)一致，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，YAP1蛋白存在Beclin1結(jié)合位點(diǎn)，YAP1蛋白結(jié)構(gòu)中WW區(qū)域是Beclin1與YAP1結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)[13]，推測(cè)消巖湯聯(lián)合順鉑可以干預(yù)Beclin1，進(jìn)而直接調(diào)控YAP1表達(dá)進(jìn)而影響下游基因，從而改變肺癌耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。為進(jìn)一步探討機(jī)制，通過檢測(cè)消巖湯聯(lián)合順鉑干預(yù)高表達(dá)YAP1耐藥細(xì)胞株和低表達(dá)YAP1耐藥細(xì)胞株中Beclin1、P-gp和LRP蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Beclin1表達(dá)與YAP1一致，而P-gp和LRP部分受YAP1表達(dá)影響，推測(cè)YAP1是否通過某些通路反向影響B(tài)eclin1。因此查詢相關(guān)文獻(xiàn)尋找YAP1與化療耐藥相關(guān)蛋白如p-STAT3[16]、mTOR[17]和TAZ[18]有關(guān)，并且通過消巖湯聯(lián)合順鉑干預(yù)不同表達(dá)YAP1肺癌耐藥細(xì)胞株觀察相關(guān)蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)TAZ蛋白表達(dá)與YAP1表達(dá)一致，結(jié)合Maroni等[19]研究發(fā)現(xiàn)TAZ與腫瘤自噬密切相關(guān)，推測(cè)消巖湯聯(lián)合順鉑可能通過抑制YAP1，激活下游TAZ分子，反向抑制Beclin1的表達(dá)。因此，消巖湯聯(lián)合順鉑干預(yù)肺癌順鉑耐藥可能主要與Beclin1-YAP1環(huán)路相關(guān)。進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，構(gòu)建了不同基因表達(dá)BALB/c小鼠移植瘤模型，通過消巖湯聯(lián)合順鉑觀察各組小鼠移植瘤體積變化情況，結(jié)果與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相似，發(fā)現(xiàn)Ad-Beclin1組和Ad-YAP1組腫瘤體積明顯大于對(duì)照組，Si-Beclin1組和Si-YAP1組腫瘤體積明顯小于對(duì)照組。說明消巖湯逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥與Beclin1和YAP1可能具有相關(guān)性。

本研究發(fā)現(xiàn)消巖湯可能通過Beclin1-YAP1環(huán)路逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥，為中醫(yī)藥逆轉(zhuǎn)化療耐藥提供了新的思路，也為中醫(yī)藥治療腫瘤提供新的證據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Xiaoyan Decoction reverses cisplatin resistance in lung cancer by intervening Beclin1-YAP1 loop

YANG Pei-ying, LIU Hong-gen, JIA Ying-jie

National Clinical Research Center for Chinese Medicine Acupuncture and Moxibustion, Department of Oncology, First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300381, China

To explore the mechanism of Xiaoyan Decoction (消巖湯) on reversing cisplatin resistance in lung cancer.Lung adenocarcinoma cells with high expression of Beclin1 drug-resistance (A549/DDP), low expression of Beclin1 A549/DDP, high expression of Yes-associated protein 1 (YAP1) A549/DDP and low expression of YAP1 A549/DDP were intervened by Xiaoyan Decoction and cisplatin respectively, Transwell and clone formation experiments were adopted; Western blotting was used to detect Beclin1, YAP1, P-glycoprotein (P-gp), lung resistance-related protein (LRP), transcriptional co activator with PDZ-binding motif (TAZ), phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3 (p-STAT3) and mammalian target of rapamycin (mTOR) expressions. BALB/c mice were sc cells with high expression of Beclin1 A549/DDP, low expression of Beclin1 A549/DDP, high expression of YAP1 A549/DDP and low expression of YAP1 A549/DDP to establish transplanted tumor models. Mice were ig Xiaoyan Decoction and intratumoral injection of cisplatin for 14 d, Beclin1, YAP1, P-gp and LRP proteins expressions in tumor were detected by immunohistochemistry.Xiaoyan Decoction combined with cisplatin enhanced the invasion and proliferation of lung cancer cell lines with high expression of Beclin1 and high expression of YAP1 (< 0.05), while the invasion and proliferation of lung cancer cell lines with low expression of Beclin1 and low expression of YAP1 were weakened (< 0.05). The protein expression levels of Beclin1, YAP1, P-gp and LRP in lung cancer cell lines with low expression of Beclin1 were significantly decreased (< 0.05). The protein expression levels of Beclin1, YAP1, P-gp and LRP in lung cancer cell lines with high expression of Beclin1 were significantly increased (< 0.05). The expression levels of p-STAT3, TAZ, Beclin1, YAP1, P-gp and LRP in lung cancer cell lines with low expression of YAP1 were significantly decreased (< 0.05). The expression levels of TAZ, Beclin1, YAP1 and P-gp protein in lung cancer cell lines with high expression of YAP1 were significantly increased (< 0.05). In the transplanted tumor model of mice, tumor of high-expression Beclin1 group and high-expression YAP1 group were larger than control group, while tumor of low-expression Beclin1 group and low-expression YAP1 group were smaller than control group.Xiaoyan Decoction directly affects the expression of YAP1 through Beclin1, and Xiaoyan Decoction can affect the expression of Beclin1 through YAP1-TAZ pathway. Xiaoyan Decoction may reverse the cisplatin resistance of lung cancer by intervening Beclin1-YAP1 loop.

Xiaoyan Decoction; lung cancer; cisplatin; drug resistance; Beclin1; YAP1

R285.5

A

0253 - 2670(2023)04 - 1184 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.04.018

2022-09-30

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81904151）

楊佩穎，博士，副主任醫(yī)師，從事中西醫(yī)結(jié)合腫瘤研究。Tel: 18602286127 E-mail: yangpeiying27@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]