普洱茶素II改善高脂血癥ApoE?/?小鼠動脈粥樣硬化作用機制研究

王鑫玉，趙一慕，高 云，陰紫鈺，王凌瀟，馬家樂，趙云芳，鄭 姣，李 軍

普洱茶素II改善高脂血癥ApoE?/?小鼠動脈粥樣硬化作用機制研究

王鑫玉1, 2，趙一慕1, 2，高 云1, 2，陰紫鈺1, 2，王凌瀟1, 2，馬家樂1, 2，趙云芳1，鄭 姣1*，李 軍1, 2*

1. 北京中醫藥大學 中醫藥研究院中藥現代研究中心，北京 102488 2. 北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488

研究普洱茶素II對高脂血癥誘發動脈硬化ApoE基因敲除小鼠（ApoE?/?）的治療效果及作用機制。ApoE?/?小鼠通過喂養高脂飼料建立動脈粥樣硬化動物模型，造模成功后將小鼠隨機分為對照組、模型組、阿托伐他汀（30 mg/kg）組和普洱茶素II低、高劑量（50、100 mg/kg）組，給藥6周后檢測小鼠血漿總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和非高密度脂蛋白膽固醇（non-high density lipoprotein cholesterol，non-HDL-C）水平，以及主動脈流出道斑塊面積等指標的差異。體外培養人臍靜脈內皮細胞HUVEC和人外周血單核細胞THP-1，檢測普洱茶素II對氧化低密度脂蛋白（oxidized low density protein，ox-LDL）誘發單核與內皮細胞黏附的影響，利用Western blotting對蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）/血管細胞黏附因子（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）通路相關蛋白表達進行檢測。普洱茶素II顯著抑制了高脂飲食誘導ApoE?/?小鼠的體質量、肝臟質量、肝臟指數、附睪脂肪質量和附睪脂肪指數（＜0.05、0.01），降低血漿TC、TG、non-HDL-C水平（＜0.05、0.01），升高HDL-C水平（＜0.05），減少主動脈流出道脂質沉積。體外實驗證實，普洱茶素II顯著抑制HUVEC與THP-1細胞間的黏附（＜0.05），抑制ox-LDL誘導的HUVEC細胞中VCAM-1、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）和Akt/NF-κB通路相關蛋白表達（＜0.05、0.01）。普洱茶素II能夠顯著改善ApoE?/?小鼠的肥胖、脂代謝紊亂、主動脈斑塊沉積，通過調控Akt/NF-κB/VCAM-1通路抑制內皮細胞與單核細胞的黏附，進而抑制動脈粥樣硬化的發生與發展。

普洱茶素II；高脂血癥；ApoE?/?；脂代謝異常；動脈粥樣硬化；蛋白激酶B/核因子-κB通路

動脈粥樣硬化是由于膽固醇、脂肪及其他物質在動脈內、外壁積聚形成斑塊的病理過程，是心腦血管疾病最重要的誘發因素之一[1]。動脈粥樣硬化的病因復雜，涉及血管內皮細胞、單核巨噬細胞和血管平滑肌細胞等多種細胞的參與。其中血管內皮細胞與血液循環中的單核巨噬細胞的黏附被認為是誘發動脈粥樣硬化發生與發展的關鍵因素[2]。血液中的低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）富含膽固醇并極易被氧化修飾為氧化低密度脂蛋白（oxidized low density protein，ox-LDL）。血液中積累的ox-LDL刺激血管內皮細胞產生炎癥反應，進而增加細胞黏附因子如血管細胞黏附因子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）與單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）的表達。血液循環中的單核細胞受到內皮黏附因子的招募后，與血管內皮細胞發生黏附并侵入到血管內皮下成為巨噬細胞，巨噬細胞吞噬ox-LDL成為泡沫細胞，泡沫細胞不斷累積成為動脈粥樣硬化斑塊[3]。因此，抑制ox-LDL誘發的單核細胞與內皮細胞的黏附是抑制動脈粥樣硬化發生和發展的關鍵因素之一。

普洱茶是以云南特產的普洱茶(Mast.) Chang的干燥嫩葉為原料，加工而成的微生物后發酵茶。其茶葉經過酶解、揉捻、曬干和軋制，然后在蒸煮、壓制和后發酵（自然陳化或堆積發酵）中成型。后發酵過程中，微生物和微生物酶將碳水化合物和酚類化合物進行生物轉化，使普洱茶形成獨特的口感和風味[4]。研究表明，普洱茶具有改善糖脂代謝紊亂、調血脂、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化等多種生物活性[5-7]。普洱茶富含黃酮類、兒茶素類、酚酸類黃烷醇聚合物、嘌呤類生物堿、可水解鞣質等多種活性成分[8-10]。特別是在高溫高濕的后發酵過程中，普洱茶嫩葉中的主要成分茶多酚發生各種反應，形成多種兒茶素和有機酸類似物。本課題組前期對普洱茶進行了系統的化學成分研究，分離鑒定了35個化合物，獲得多個新化合物，并證實新化合物普洱茶素I～IV是普洱茶后發酵過程中微生物的代謝產物[5,11-12]。為了深入研究普洱茶改善脂代謝紊亂及動脈粥樣硬化的藥效物質和作用機制，選擇含量較高的特征性成分普洱茶素II，利用體內和體外模型探討其作用機制，為普洱茶的開發和應用提供理論支持。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性C57BL/6背景ApoE?/?小鼠，6～8周齡，體質量（20±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0011。SPF級高脂飼料于北京科奧協力公司定制，飼料配方為基礎飼料添加0.2%膽固醇，15%豬油。實驗期間實驗環境室溫保持在21～24 ℃，相對濕度保持在40%～60%，12 h明暗交替。動物實驗經北京中醫藥大學動物實驗倫理審查委員會批準（批準號No.BUCM-4-2016040301-2001）。

1.2 細胞

人臍靜脈內皮細胞HUVEC和人外周血單核細胞THP-1購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心。

1.3 藥品與試劑

普洱茶素II由藥明康德公司合成，其結構的光譜數據（1H NMR和13C NMR）與文獻報道數據[7]比較得到驗證，質量分數＞98%；DMEM細胞基礎培養液（批號18721015）購自美國Corning公司；RPMI 1640細胞基礎培養液（批號8122261）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，批號12483020）、0.25%胰酶（批號25200072）、雙抗（批號15140163）均購自美國Gibco公司；ox-LDL（批號2018-10-25）購自廣州奕源生物科技有限公司；DAPI（批號190821）購自北京索萊寶科技有限公司；磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）抗體（批號9271T）、磷酸化核因子-κB（phosphorylated nuclear factor-κB，p-NF-κB）抗體（批號3033P）、NF-κB抗體（批號8242P）購自美國CST公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號HRP-60004）、Akt抗體（批號10176-2-AP）購自美國Proteintech公司；MCP-1抗體（批號22115）購自美國Novus公司；VCAM-1抗體（批號EPR5047）購自英國Abcam公司；HRP標記的羊抗鼠二抗（批號7076P2）、HRP標記的羊抗兔二抗（批號7074P2）購自美國Santa公司；三酰甘油（triglycerides，TG）測定試劑盒（批號218081）、總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒（批號212072）購自北京中生北控生物科技股份有限公司；其他化學試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.4 儀器

MCO-18AIC型CO2細胞培養箱、SIM-F140AY65型制冰機（日本Sanyo公司）；5810R型離心機（德國Eppendorf公司）；EnSpire型多模式微孔板檢測儀（美國PerkinElmer公司）；Mini PROTEAN型電泳儀、電轉儀（美國Bio-Rad公司）；FACSCanto II型流式細胞儀（美國BD公司）；FV1000型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；ICC50HD型光學顯微鏡、CM1950型冷凍切片機（德國Leica公司）。

2 方法

2.1 體內實驗

2.1.1 造模、分組及給藥 小鼠適應性飼養1周后隨機分為對照組（6只）、模型組（8只）、阿托伐他?。?0 mg/kg）組（7只）和普洱茶素II低、高劑量（50、100 mg/kg）組（各7只）。除對照組給予正常飼料外，其他各組用高脂飼料喂養2周造成高脂模型后，開始ig相應藥物，1次/d，連續6周，給藥同時維持高脂飲食。

2.1.2 小鼠體質量、肝質量、附睪脂肪質量的測定及主動脈流出道取材 各組小鼠給藥6周后，禁食不禁水6 h，稱定小鼠質量、眼眶取血，全血肝素抗凝后4000 r/min離心10 min，取上清血漿備用。小鼠麻醉后將其四肢固定于操作板，打開胸腔使心臟暴露，右心房剪小角，灌流針頭稍插入心尖處，經左心室逆行灌流PBS緩沖液，心臟充盈后右心耳剪孔使血液流出。灌流結束后摘取肝臟和附睪脂肪稱定質量。從頭臂干主動脈起剝至骸總動脈分叉處整體剝離心臟及整個腹主動脈，于4%多聚甲醛中固定。肝臟/附睪脂肪指數以肝臟/附睪脂肪和體質量的比值計算。

2.1.3 血漿中血脂水平的測定 小鼠血漿TC和TG按照TC和TG檢測試劑盒說明書測定，血漿高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）利用聚乙二醇沉淀法[13]進行測定，非高密度脂蛋白膽固醇（non-high density lipoprotein cholesterol，non-HDL-C）含量由TC扣除HDL-C的含量計算得到。

2.1.4 心主動脈流出道切片油紅O染色 將心臟的冰凍包埋塊固定于冰凍切片機上，從心底向主動脈開口方向進行連續切片，至出現主動脈瓣膜，以7 μm厚度收集連續切片，至主動脈瓣膜消失，每間隔10張切片進行油紅O染色，細胞核用蘇木素復染，顯微鏡采集圖像后對主動脈流出道的動脈粥樣硬化病變進行組織學觀察，用Image J軟件對斑塊面積進行測量。

2.2 體外實驗

2.2.1 內皮細胞與單核細胞的黏附實驗 取處于對數生長期的HUVEC細胞接種于96孔板，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養24 h至細胞融合度達到70%～80%，用含2%胎牛血清的DMEM完全培養基饑餓細胞24 h。設置對照組、模型組和給藥組。對照組用含2%胎牛血清的DMEM完全培養基培養，模型組及各給藥組以添加50 μg/mL ox-LDL的含2%胎牛血清的DMEM完全培養基刺激細胞，給藥組以100 μL不同濃度（50、100 μmol/L）的普洱茶素II處理細胞24 h。THP-1細胞用含2.5 μmol/L的BCECF AM熒光染料的RPMI 1640基礎培養基（不含血清）進行標記，37 ℃恒溫避光孵育30 min，1000 r/min離心5 min，棄去上清，PBS洗滌細胞3次去除未標記BCECF AM熒光染料，調節細胞密度為5×105個/mL。將已標記的THP-1細胞20 μL輕柔加入至上述用于實驗的HUVEC細胞中，于37 ℃共孵育30 min后吸去上清，用PBS輕柔清洗2次以除去未黏附于HUVEC細胞上的THP-1細胞。熒光倒置顯微鏡下觀察HUVEC細胞與THP-1細胞的黏附情況。每個樣品孔隨機取10個視野進行拍照，每個實驗組設3個復孔，實驗重復3次，利用Image J軟件對其黏附程度進行定量分析。

2.2.2 Western blotting檢測Akt/NF-κB/VCAM-1通路相關蛋白表達 HUVEC細胞接種于12孔板，培養24 h后至細胞融合度達到80%。按照細胞黏附實驗ox-LDL（50 μg/mL）刺激與普洱茶素II（10、50、100 μmol/L）處理HUVEC細胞后，用預冷的PBS輕柔清洗細胞3次，加入預冷的細胞裂解液200 μL，待細胞裂解后于95 ℃將蛋白變性，離心取上清置于?80 ℃冰箱保存備用。蛋白樣品經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，封閉后分別加入VCAM-1、MCP-1、p-Akt、Akt、p-NF-κB、NF-κB、GAPDH抗體，TBST洗滌后，加入二抗孵育，用ECL增強化學發光液曝光條帶，顯影后用Image J軟件對條帶進行定量分析。

2.3 統計學分析

3 結果

3.1 普洱茶素II對ApoE?/?小鼠體質量、肝臟與附睪脂肪質量及指數的影響

脂代謝紊亂與肥胖、脂肪肝等疾病密切相關。如圖1所示，與對照組比較，模型組小鼠的體質量、肝臟質量、肝臟指數、附睪脂肪質量和附睪脂肪指數均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，普洱茶素II高劑量組和阿托伐他汀組小鼠體質量、肝臟質量與指數、附睪脂肪質量與指數均顯著降低（＜0.05、0.01），普洱茶素II低劑量組小鼠肝臟質量顯著降低（＜0.05）。表明普洱茶素II能夠顯著抑制高脂血癥小鼠體質量、肝質量及體脂含量。

3.2 普洱茶素II對ApoE?/?小鼠血脂的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠血漿TC、TG、non-HDL-C水平均顯著升高（＜0.01），HDL-C水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠血漿TC、TG、non-HDL-C水平均顯著降低（＜0.05、0.01），普洱茶素II高劑量組和阿托伐他汀組HDL-C水平顯著升高（＜0.05），表明普洱茶素II能夠顯著改善脂代謝異常。

3.3 普洱茶素II對ApoE?/?小鼠心臟主動脈流出道斑塊面積的影響

ApoE?/?小鼠經過高脂飼料喂養后可自發產生動脈粥樣硬化。主動脈流出道連續切片定量是評估動脈粥樣硬化程度的標準方法之一，因此采用流出道斑塊沉積的比較，驗證普洱茶素II對動脈粥樣硬化的治療作用。如圖3所示，與對照組比較，模型組小鼠心臟主動脈流出道斑塊面積顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠主動脈流出道斑塊面積均顯著減少（＜0.05、0.01）。表明普洱茶素II能夠顯著抑制高血脂誘發的動脈粥樣硬化。

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖2 普洱茶素II對ApoE?/?小鼠血漿TC、TG、HDL-C和non-HDL-C水平的影響(, n = 6～8)

箭頭為斑塊

3.4 普洱茶素II抑制ox-LDL誘導的內皮細胞與單核細胞黏附

ox-LDL誘發的血管內皮細胞與單核細胞的黏附，是動脈粥樣硬化的最重要誘因之一。因此，本研究利用血管HUVEC細胞和單核THP-1細胞構建體外模型，探討普洱茶素II對動脈粥樣硬化的作用機制。如圖4所示，ox-LDL刺激后HUVEC細胞與THP-1細胞的黏附作用顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，普洱茶素II顯著抑制ox-LDL誘導的HUVEC細胞與THP-1細胞的黏附（＜0.05），且呈劑量相關性。表明普洱茶素II對ox-LDL誘導的單核與內皮細胞黏附有顯著的抑制作用。

圖4 普洱茶素II對ox-LDL誘導的HUVEC細胞與THP-1細胞黏附的影響(, n = 6)

3.5 普洱茶素II對ox-LDL誘導細胞黏附因子蛋白表達的影響

ox-LDL通過誘導內皮細胞表達黏附分子和趨化因子，募集單核細胞向內皮細胞黏附進而形成動脈粥樣硬化。如圖5所示，ox-LDL刺激HUVEC細胞24 h后，HUVEC細胞中VCAM-1和MCP-1蛋白表達水平均顯著升高（＜0.01），普洱茶素II（50、100 μmol/L）顯著抑制ox-LDL誘導的HUVEC細胞中VCAM-1和MCP-1蛋白表達水平（＜0.05、0.01）。表明普洱茶素II可能是通過抑制VCAM-1和MCP-1的表達來抑制內皮細胞與單核細胞的黏附。

3.6 普洱茶素II對HUVEC細胞Akt/NF-κB通路相關蛋白表達的影響

ox-LDL誘導的內皮功能障礙在心血管疾病尤其是動脈粥樣硬化的發生發展中起著重要作用，而炎癥引起的內皮損傷是內皮功能障礙的主要誘因。如圖6所示，ox-LDL刺激后Akt和NF-κB的磷酸化水平顯著升高（＜0.01），100 μmol/L普洱茶素II顯著抑制ox-LDL誘導的HUVEC細胞Akt和NF-κB的磷酸化水平（＜0.01），50 μmol/L普洱茶素II顯著抑制ox-LDL誘導的HUVEC細胞NF-κB的磷酸化水平（＜0.05），表明普洱茶素II通過Akt/NF-κB通路抑制內皮細胞炎癥反應。

圖5 普洱茶素II對ox-LDL誘導HUVEC細胞中VCAM-1、MCP-1蛋白表達的影響(, n = 3)

圖6 普洱茶素II對ox-LDL刺激的HUVEC細胞中Akt、NF-κB蛋白表達及其磷酸化水平的影響(, n = 3)

4 討論

動脈粥樣硬化具有復雜的發病機制，包括脂質浸潤、炎癥損傷、氧化應激等方面，其主要成因是動脈壁脂代謝改變導致的脂質堆積[14]。目前普洱茶提取物對高脂血癥、糖尿病的治療作用研究已有報道。如普洱茶水提物、醋酸乙酯萃取組分對肥胖ICR小鼠體質量、體脂降低作用明顯[15]；普洱茶水提物能夠促進Wistar大鼠骨骼肌葡萄糖轉運，改善大鼠胰島素抵抗等[16]。但是普洱茶活性成分抗動脈粥樣硬化的作用及其機制尚缺乏系統研究。本研究利用前期課題組發現的普洱茶特征性成分普洱茶素II，系統研究其改善高脂血癥誘發動脈粥樣硬化的體內藥效與作用機制。發現普洱茶素II能呈劑量相關性地降低小鼠的TC、TG和non-HDL-C水平，減少附睪脂肪質量，抑制主動脈流出道的脂質沉積，能降低其體內血脂和動脈粥樣硬化水平。

動脈粥樣硬化是血管壁的慢性炎性疾病。它源于修飾的脂蛋白、免疫細胞和內皮細胞之間的相互作用。因此內皮功能障礙和單核細胞-內皮細胞相互作用是動脈粥樣硬化發生和發展的關鍵。LDL-C經氧化修飾形成ox-LDL，ox-LDL不同于天然LDL-C，它可激活損傷內皮細胞，促使細胞趨化因子、黏附分子和集落因子分泌，促進內皮細胞與單核細胞的黏附[17]。當內皮細胞經歷炎癥激活時，選擇素、VCAM-1和細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的表達增加，促進單核細胞的黏附[18-19]，從而促進動脈粥樣硬化斑塊的形成和發展。本研究發現，普洱茶素II能顯著抑制ox-LDL誘導的THP-1細胞與HUVEC細胞的黏附，并抑制了ox-LDL刺激的HUVEC細胞中VCAM-1和MCP-1的表達。內皮細胞中黏附因子的表達受多個通路調控，其中Akt/NF-κB通路是調控炎癥因子刺激內皮細胞炎癥因子表達的重要炎癥通路[20]。本研究結果顯示，普洱茶素II顯著抑制ox-LDL誘導后HUVEC細胞中Akt和NF-κB的磷酸化激活。推測普洱茶素II通過Akt/NF-κB通路抑制內皮細胞炎癥反應進而抑制黏附因子的表達與動脈粥樣硬化的發生與發展。

綜上，本研究表明，普洱茶素II作為普洱茶的特征成分能夠顯著改善ApoE?/?小鼠的肥胖、脂代謝紊亂和主動脈斑塊沉積。進一步的機制研究顯示，針對ox-LDL誘發的內皮細胞與單核細胞的黏附，普洱茶素II通過調控Akt/NF-κB炎癥通路，抑制MCP-1與VCAM-1的蛋白表達，進而抑制動脈粥樣硬化的發生與發展，推測普洱茶素II是普洱茶改善脂代謝紊亂與動脈粥樣硬化的活性成分。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of puerin II on improving atherosclerosis in ApoE?/?mice with hyperlipidemia

WANG Xin-yu1, 2, ZHAO Yi-mu1, 2, GAO Yun1, 2, YIN Zi-yu1, 2, WANG Ling-xiao1, 2, MA Jia-le1, 2, ZHAO Yun-fang1, ZHENG Jiao1, LI Jun1, 2

1. Beijing Research Institute of Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China 2. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

To study the therapeutic effect and mechanism of puerin II on ApoE?/?mice with hyperlipidemia induced atherosclerosis.ApoE?/?mice were fed high-fat diet to establish atherosclerotic animal models. After successful modeling, mice were randomly divided into control group, model group, atorvastatin (30 mg/kg) group and puerin II low-and high dose (50, 100 mg/kg) groups. After 6 weeks of administration, the difference of total cholesterol (TC), triglycerides (TG), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) and non-high density lipoprotein cholesterol (non-HDL-C) levels, as well as plaque area of aortic sinus were detected. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and human peripheral blood mononuclear cells (THP-1) were cultured. The effects of puerin II on adhesion of monocytes to endothelial cells induced by oxidized low density lipoprotein (ox-LDL) were detected. Western blotting was used to detect protein kinase B (Akt)/nuclear factor-κB (NF-κB)/vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) pathway related protein expressions was detected.Puerin II significantly inhibited the body weight, liver weight, liver index, epididymal fat weight, and epididymal fat index (< 0.05, 0.01), decreased TC, TG, and non-HDLc levels in plasma (< 0.05, 0.01), increased HDL-C level (< 0.05), reduced lipid deposition in aortic sinus.experiments confirmed that puerin II significantly inhibited the adhesion between HUVEC and THP-1 cells (< 0.05), inhibited VCAM-1, monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), and Akt/NF-κB pathway related protein expressions in HUVEC cells induced by ox-LDL (< 0.05, 0.01).Puerin II can significantly improve the obesity, lipid metabolism disorder, and aortic plaque deposition of ApoE?/?mice by regulating Akt/NF-κB/VCAM-1 pathway, inhibit the adhesion of endothelial cells and monocytes, thereby inhibiting the occurrence and development of atherosclerosis.

puerin II; ApoE?/?; hyperlipidemia; abnormal lipid metabolism; atherosclerosis; protein kinase B/nuclear factor-κB

R285.5

A

0253 - 2670(2023)04 - 1157 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.04.015

2022-10-26

國家自然科學基金資助項目（82074050）；國家重點研發計劃（2018YFC1706400）

王鑫玉（1997—），女，碩士研究生，研究方向為中藥藥效物質基礎及作用機制。E-mail: wxywukong@163.com

鄭 姣，碩士生導師，副研究員，主要從事中藥藥理研究。E-mail: zj98v2@163.com

李 軍，博士生導師，研究員，主要從事中藥藥效物質及作用機制研究。E-mail: drlj666@163.com

[責任編輯 李亞楠]