補肺活血膠囊大鼠體內代謝產物鑒定及代謝途徑分析

任 慧，郭 盛*，張祎盈，李 全，王恒斌，耿婉麗，錢大瑋，段金廒

補肺活血膠囊大鼠體內代謝產物鑒定及代謝途徑分析

任 慧1，郭 盛1*，張祎盈1，李 全2，王恒斌2，耿婉麗3，錢大瑋1，段金廒1

1. 南京中醫藥大學 中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程研究中心/江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心/江蘇省方劑高技術研究重點實驗室，江蘇 南京 210023 2. 雷允上藥業集團有限公司，江蘇 蘇州 215003 3. 廣東雷允上藥業有限公司，廣東 云浮 527300

研究補肺活血膠囊（Bufei Huoxue Capsules，BHC）在大鼠血漿、膽汁、尿液、糞便中的原型成分及其代謝產物，歸納總結不同類型化合物的體內代謝規律。大鼠ig BHC后，收集血漿、膽汁、尿液和糞便樣品并進行預處理，采用超高效液相色譜-飛行時間質譜（ultra-high performance liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）及質量虧損過濾技術，分別在正、負離子模式下對原型成分及代謝產物進行分析鑒定。共檢測到沒食子酸、芍藥苷、毛蕊異黃酮、新補骨脂異黃酮、()-異補骨脂二氫黃酮、補骨脂苷等原型成分及代謝產物67個，其中酚酸類成分10個、單萜類成分7個、黃酮類成分35個、香豆素類成分12個、皂苷類成分3個，主要代謝途徑包括氧化、還原、甲基化、葡糖醛酸結合、硫酸結合等。初步闡明了BHC大鼠體內的代謝產物及其代謝轉化特征，為基于體內過程揭示其藥效物質基礎奠定了基礎，為其臨床安全用藥提供了科學依據。

補肺活血膠囊；代謝產物鑒定；代謝途徑分析；UPLC-Q-TOF-MS；沒食子酸；芍藥苷；毛蕊異黃酮；新補骨脂異黃酮；()-異補骨脂二氫黃酮；補骨脂苷；黃芪甲苷

補肺活血膠囊（Bufei Huoxue Capsules，BHC）收載于《中國藥典》2020年版，由黃芪、赤芍、補骨脂3味中藥組成，具有益氣活血、補肺固腎等功效，是治療肺心病（緩解期）屬氣虛血瘀證的有效復方[1]。大量研究表明，BHC被廣泛應用于塵肺病[2]、肺纖維化[3]、慢性阻塞性肺疾病[4]、新型冠狀病毒肺炎[5-7]等多種呼吸道疾病的治療。現代研究顯示，BHC含有酚酸類、單萜類、黃酮類、香豆素類、皂苷類等化學成分[8]，在質量控制[9-10]、藥理作用[11]、臨床應用[3-4]等多個領域已開展了系列研究，然而關于其活性組分體內代謝過程研究報道較少。課題組前期對BHC吸收入血的原型成分進行“藥-時”曲線繪制及藥動學參數計算，闡明其體內吸收規律[12]，但其體內代謝途徑及代謝產物尚未見報道。

藥物體內代謝產物研究可明確活性組分在體內的生物轉化規律，為其藥效物質基礎的闡明提供參考。中藥復方具有成分組成復雜、化學結構及代謝途徑多樣、內源性成分干擾因素多、生物樣本中目標組分濃度低等特點，增加了其代謝產物鑒定的難度[13]。唐清等[8]采用UFLC-Triple TOF MS/MS技術對BHC中體外化學物質進行了定性分析，共確證和指認了42個化合物。本實驗在此基礎上采用超高效液相色譜-飛行時間質譜儀（ultra-high performance liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS），運用碰撞能量梯度（MSE）及質量虧損過濾技術，快速分析鑒定BHC在大鼠血漿、膽汁、尿液、糞便中的代謝產物，并對黃芪中的毛蕊異黃酮等黃酮類及黃芪甲苷等皂苷類成分、赤芍中的沒食子酸等酚酸類及芍藥苷等單萜類成分、補骨脂中的新補骨脂異黃酮等黃酮類及補骨脂苷等香豆素類成分的代謝規律進行闡釋，以期闡明BHC在生物體內的代謝規律，為臨床安全用藥提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

AcquityTMUPLC系統、SynaptTMQ-TOF質譜儀（配有Lock-spray接口，電噴霧離子源ESI）、MassLynx 4.2質譜工作站軟件、MetaboLynx XS分析軟件（美國Waters公司）；KQ-250E型超聲波清洗器（頻率40 kHz，功率250 W，昆山禾創超聲儀器有限公司）；MS105型萬分之一、ML204型十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）；Anke GL-16G Ⅱ型離心機（上海安亭科學儀器廠）；Millipore-Q純水系統（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

對照品沒食子酸（批號Y19M8C36143）、芍藥苷（批號X12A8C33672）、氧化芍藥苷（批號Z14J9S63652）、沒食子酰芍藥苷（批號P08A10S85131）、芍藥內酯苷（批號Y15D8H50784）、毛蕊異黃酮（批號Y24N9Y75652）、芒柄花素（批號F27J7S18516）、新補骨脂異黃酮（批號ZN1112BD13）、補骨脂寧（批號ZN1112BA13）、3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷（批號Y28M10H84302）、()-異補骨脂二氫黃酮（批號YM0509HA1）、補骨脂甲素（批號C19J8G28797）、補骨脂苷（批號Y07A7S12664）、補骨脂素（批號C22A9Q68562）、異補骨脂苷（批號Y27A9S60238）、異補骨脂素（批號C05M10Q82078）、黃芪甲苷（批號J04M8T30363），以上對照品質量分數均≥98%，購自上海源葉生物科技有限公司；BHC（批號022004）由廣州雷允上藥業有限公司提供。甲醇、乙醇為色譜純（德國Merck公司）；甲酸為色譜純（美國ACS公司）；超純水為Milli-Q純水機制備。

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體質量200～220 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK（浙）2019-0001，并經南京中醫藥大學動物中心倫理委員會批準（倫理審批號202010A027），飼養于南京中醫藥大學動物中心屏障系統內，溫度（20±2）℃，濕度（60±5）%，12 h光照和黑暗循環，自由進食及進水。

2 方法

2.1 BHC給藥溶液及對照品溶液的制備

精密稱取BHC粉末適量，以0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液混懸制成質量濃度為0.378 g/mL的混懸液。分別精密稱取各對照品適量，甲醇溶解并定容，分別制成沒食子酸、芍藥苷、氧化芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、芍藥內酯苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、新補骨脂異黃酮、補骨脂寧、3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷、()-異補骨脂二氫黃酮、補骨脂甲素、補骨脂苷、補骨脂素、異補骨脂苷、異補骨脂素、黃芪甲苷為2.143、1.452、1.562、1.937、1.748、1.194、1.375、1.465、1.356、1.160、2.047、1.503、1.382、2.405、2.156、2.366、1.794mg/mL的對照品溶液。

2.2 動物分組及給藥

雄性SD大鼠18只，隨機分為空白組、血漿組、膽汁組、尿液/糞便組；空白組分為血漿空白組、膽汁空白組、尿液/糞便空白組，每組3只，共9只。其余各組均為給藥組，每組3只。空白組給予等體積0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液，其余各組ig BHC 3.78 g/kg，連續給藥3 d。

2.3 生物樣品的采集

大鼠末次給藥前禁食12 h，自由飲水。血漿組大鼠，于給藥后0.5、1、2、4、6、8、10 h經眼眶靜脈叢分別取血300 μL，分別置于預先涂有1%肝素鈉的EP管中，4000 r/min離心10 min，取上清，即得各時間點血漿樣品；膽汁組大鼠麻醉后，做膽管插管手術，收集10 h內膽汁。尿液/糞便組大鼠置于代謝籠中，分別收集36 h內尿液、糞便樣品，每6 小時收集1次。3個空白組大鼠，分別同法收集血漿樣品、膽汁樣品、尿液及糞便樣品。于?80 ℃冰箱保存備用。

2.4 生物樣品預處理

參考文獻中生物樣品的處理方式進行樣品預處理[14-15]。取血漿組3只大鼠各時間點血漿樣品各50 μL，等量混合（共21個樣品），渦旋30 s，取混勻后的血漿樣品500 μL，加入3倍體積的乙腈，渦旋30 s，離心（13 000 r/min、10 min、4 ℃），取上清，37 ℃離心濃縮至干，以100 μL 50%甲醇復溶，離心（13 000 r/min、10 min、4 ℃）取上清，即得含藥血漿樣品溶液；空白血漿樣品溶液處理方法同含藥血漿樣品溶液；取膽汁組3只大鼠膽汁樣品300 μL，等量混合，渦旋30 s，取混勻后的膽汁樣品500 μL，加入500 μL乙腈沉淀蛋白，其余操作同血漿樣品，即得含藥膽汁樣品溶液；空白膽汁樣品溶液處理方法同含藥膽汁樣品溶液；取尿液組3只大鼠各時間點尿液樣品50 μL，等量混合（共18個樣品），渦旋30 s，取混勻后的尿液樣品500 μL，加入500 μL乙腈沉淀蛋白，其余操作同血漿樣品，即得含藥尿液樣品溶液；空白尿液樣品溶液處理方法同含藥尿液樣品溶液；取糞便組3只大鼠各時間點糞便樣品適量，等量混合（共18個樣品），取混勻后的糞便樣品1.0 g，加入50%甲醇300 μL，超聲30 min，離心（13 000 r/min、10 min、4 ℃），取上清液200 μL，加入200 μL甲醇，渦旋混勻，再次離心（13 000 r/min、10 min、4 ℃），取上清即得含藥糞便樣品溶液；空白糞便樣品溶液處理方法同含藥糞便樣品溶液。

2.5 色譜和質譜條件

2.5.1 色譜條件 采用ACQUITYTMUPLC BEH T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫：0～5 min，0～12% A；5～7 min，12% A；7～12 min，12%～30% A；12～15 min，30%～45% A；15～18 min，45%～85% A；18～20 min，85%～0 A，柱溫35 ℃；體積流量0.4 mL/min，進樣量4 μL。

2.5.2 質譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正、負離子模式分別掃描；錐孔電壓40 V；毛細管電壓4 kV；脫溶劑氣溫度400 ℃；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣體積流量500 L/h；錐孔氣體積流量50 L/h；MS、MS/MS碰撞能量10～40 eV；質量掃描范圍/100～1000；以亮氨酸-腦啡肽進行精準質量實時校正，鎖校質荷比分別為556.277 1（ESI+）和554.261 5（ESI?）。

2.6 數據處理

采用MassLynx 4.2質譜控制平臺，在MSE模式下采集分析樣本總離子流圖，分析各色譜峰的質譜數據，目標物篩選采用MetaboLynx XS數據處理軟件及質量虧損過濾技術，扣除空白生物樣品后，通過對比各成分對照品的保留時間及一級、二級特征離子碎片，參考相關文獻中特征離子碎片信息，推測各成分代謝產物結構及分子式。基本參數設置為分析時間1～20 min，質量虧損過濾范圍±5×104。

3 結果

3.1 大鼠血漿、膽汁、尿液、糞便UPLC-Q-TOF-MS分析

通過參考文獻中BHC提取液原型成分的質譜信息[8]，比較給藥后大鼠血漿、膽汁、尿液、糞便樣品和空白樣品的色譜圖，扣除生物樣品中的內源性成分，分析發現樣品中含有原型成分及代謝產物67個，包括10個酚酸類、7個單萜苷類、35個黃酮類、12個香豆素類、3個皂苷類成分。各含藥樣品正、負離子模式下總提取離子流圖見圖1。

3.2 酚酸類成分代謝產物鑒定及代謝途徑分析

結果顯示，給藥大鼠體內共檢測到酚酸類原型成分及代謝產物10個，見表1，具體代謝途徑見圖2。沒食子酸為赤芍中含有的酚酸類成分，本實驗以沒食子酸為例闡述該類成分的代謝規律[16]。A0為ESI?模式下得到/169的離子峰（R＝3.2 min），文獻報道赤芍中的沒食子酸相對分子質量為170[17]，推測169.014 3為其加氫準分子離子峰，脫去羧基產生質譜碎片/125.023 8 [M－H－COO]?，其保留時間及質譜與沒食子酸對照品相一致，確定該化合物為沒食子酸。A1（R＝4.6 min）與沒食子酸相差14（CH2），存在與沒食子酸相同的碎片/125，并脫去1個氧產生/167.033 4的碎片，推測為甲基化的沒食子酸。A1、A2均為沒食子酸甲基化的產物，但沒食子酸有3個酚羥基，無法確定甲基結合的具體位置。A5（R＝8.8 min）比沒食子酸小48（3O），分子式為C7H6O2，質譜碎片/119.045 3 [M－H－2H]?，推測為沒食子酸脫去3個O、A4脫去1個O生成的苯甲酸。A7準分子離子峰/373.074 7 [M－H]?，脫去甲基產生質譜碎片/359.060 2 [M－H－CH2]?，產生與A2相同的碎片/197.044 6 [M－H－C6H8O6]?，比沒食子酸大204（C6H8O6＋2CH2）、比A2大176（C6H8O6），根據元素組成分析，該化合物分子式為C15H18O11，準分子離子峰理論值為373.076 2，實測值為373.074 7，據此推測A7為沒食子酸2次甲基化后葡萄糖醛酸結合的產物。上述實驗結果顯示，沒食子酸主要發生甲基化、脫氧、脫羧基、葡糖醛酸結合、硫酸結合等反應，原型及代謝產物在尿液中均可檢測到，膽汁中以沒食子酸甲基化和沒食子酸硫酸結合產物為主，血漿及糞便樣品中檢測到的代謝產物種類較少。

圖1 大鼠空白及含藥血漿、膽汁、尿液、糞便樣品原型化合物及其代謝產物總提取離子流圖

表1 大鼠 igBHC后血漿、膽汁、尿液、糞便中原型成分及代謝產物

續表1

峰號tR/min離子模式分子式m/z誤差(×10?6)特征碎片(m/z)化合物來源 理論值實際值 F0-216.6[M＋H]+C20H20O4325.144 0325.143 8?0.62205.080 6, 149.022 7補骨脂甲素B, F F12.5[M＋H]+C20H20O5341.138 9341.137 6?3.81149.022 7F0環氧化B, U, F F214.5[M＋H]+C20H20O5341.138 9341.137 6?3.81269.096 6, 149.022 7F0氧化B, U, F F33.3[M＋H]+C20H20O8S421.095 7421.097 23.56165.089 7F0氧化, 硫酸結合B F413.6[M＋H]+C20H20O4325.144 0325.143 8?0.62269.169 5, 205.080 6 F0異構體B F511.1[M＋H]+C26H28O10501.176 1501.176 30.40223.152 3F0葡糖醛酸結合B F614.7[M＋H]+C26H28O10501.176 1501.176 30.40149.133 6F4葡糖醛酸結合B F716.5[M＋H]+C20H18O4323.128 3323.127 5?2.48147.117 9F1重排, 脫水B, U F814.0[M＋H]+C20H18O4323.128 3323.129 33.09147.117 9, 121.101 2F1重排, 脫水B G08.5[M－H]?C17H18O9365.087 3365.087 30.00203.033 3, 175.025 1, 159.044 0補骨脂苷P, B, U, F G113.6[M＋H]+C11H6O3187.039 5187.038 8?3.74159.118 0, 131.084 9補骨脂素P, B, U, F G29.8[M＋H]+C11H6O4203.034 4203.035 55.42175.147 8, 147.044 8G1氧化B, U G35.7[M＋H]+C11H8O4205.050 1205.050 0?0.49187.037 8, 131.051 3G2還原B, U G45.9[M＋H]+C11H10O4207.065 7207.065 70.00189.053 9G3還原B, U G59.3[M＋H]+C11H8O5221.045 0221.043 4?7.24203.033 6, 165.091 1G2水合P, B, U G64.5[M＋H]+C11H10O5223.060 6223.059 7?4.03205.048 4, 179.047 5G5還原B, U G74.9[M＋H]+C11H8O6237.039 9237.039 8?0.42191.035 2, 165.091 2G5氧化U G812.2[M＋H]+C11H6O7S282.991 2282.992 54.59223.136 5, 203.035 2G2硫酸結合U G99.9[M＋H]+C17H14O10379.066 5379.066 2?0.79203.035 2, 175.147 8G2葡糖醛酸結合B G108.9[M－H]?C17H18O9365.087 3365.087 30.00203.033 3, 175.025 1異補骨脂苷P, B, U, F G1114.0[M＋H]+C11H6O3187.039 5187.038 8?3.74159.118 0, 131.084 9異補骨脂素P, B, U, F H015.0[M＋H]+C41H68O14785.468 7785.464 1?5.86491.383 9, 473.363 0, 455.354 3, 437.339 5黃芪甲苷F H117.0[M+Na]+C30H50O5513.355 6513.358 25.06455.349 7, 437.337 5, 419.330 0環黃芪醇F H213.6[M+Na]+C29H48O5499.339 9499.339 2?1.40481.023 6, 463.213 7H1去甲基F

P-血漿 B-膽汁 U-尿液 F-糞便

P-plasma B-bile U-urine F-feces

圖2 酚酸類成分體內代謝途徑

3.3 單萜類成分代謝產物鑒定及代謝途徑分析

BHC中單萜類成分主要包括芍藥苷和芍藥內酯苷等，本實驗共檢測到單萜類原型成分及代謝產物7個，見表1，具體代謝途徑見圖3。B0為ESI?模式下得到/479.155 9的離子峰（R＝8.8 min，文獻報道赤芍中的芍藥苷相對分子質量為480[17]，推測/479.155 9為該化合物準分子離子峰，C-O鍵斷裂產生碎片/357.117 6 [M－H－C7H6O2]?及121.029 2 [C7H5O2]?，其保留時間和質譜行為與芍藥苷對照品相一致，確定該化合物為芍藥苷。B1為ESI?模式下得到/495.150 2的離子峰（R＝6.1 min），B1較芍藥苷多16，文獻報道[17]赤芍中存在的氧化芍藥苷相對分子質量為496，推測/495.150 2為氧化芍藥苷的準分子離子峰，存在質譜碎片/333.090 3 [M－H－C6H10O5]?，其保留時間和質譜與芍藥苷對照品一致，確定該化合物為氧化芍藥苷。B2為ESI?模式下檢測到/631.164 9的離子峰（R＝10.4 min），文獻報道[17]赤芍中存在的沒食子酰芍藥苷相對分子質量為632，比芍藥苷多152（C7H4O4），推測/631.164 9為沒食子酰芍藥苷的準分子離子峰，存在脫水產生的碎片/613.158 8 [M－H－H2O]?，并且存在與芍藥苷準分子離子峰相同的碎片/479，其保留時間和質譜與沒食子酰芍藥苷對照品相一致，確定該化合物為沒食子酰芍藥苷。B6為ESI?模式下得到/479.155 9的離子峰（R＝8.1 min），與芍藥苷保留時間相近，質譜碎片/357.117 6 [M－H－C7H6O2]?和121.028 5 [C7H5O2]?與芍藥苷相同，保留時間和質譜與芍藥內酯苷對照品相一致，據此確定該化合物為芍藥苷的同分異構體芍藥內酯苷。芍藥苷在大鼠體內代謝產物較少，主要發生氧化、甲基結合反應，且大多經糞便代謝，推測與其生物利用度較低有關。

3.4 黃酮類成分代謝產物鑒定及代謝途徑分析

黃芪和補骨脂中含有多種黃酮類成分，如毛蕊異黃酮、芒柄花素、新補骨脂異黃酮、補骨脂甲素等。黃酮類成分極性普遍較小，因此在生物體內多以硫酸、葡糖醛酸等結合產物的形式存在，增大極性以利于排出體外[18]。黃酮類成分易發生逆狄爾斯-阿德爾（retro diels-alder reaction，RDA）裂解。本實驗檢測到毛蕊異黃酮、()-異補骨脂二氫黃酮、補骨脂甲素、新補骨脂異黃酮等成分，發生氧化、還原、脫羥基、脫水、環氧化、葡糖醛酸結合、硫酸結合反應。各樣品中代謝產物不同，原型成分及代謝產物共檢測到35個，見表1，具體代謝途徑見圖4～6。

圖3 芍藥苷體內代謝途徑

圖4 毛蕊異黃酮體內代謝途徑

圖5 新補骨脂異黃酮和3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷體內代謝途徑

本實驗以毛蕊異黃酮和()-異補骨脂二氫黃酮為例，分別闡釋異黃酮類與二氫黃酮類成分的代謝規律。C0為ESI+模式下得到/285的離子峰（R＝13.1 min），文獻報道黃芪中的毛蕊異黃酮相對分子質量為284，推測/285.074 3為毛蕊異黃酮的準分子離子峰，存在質譜碎片/270.051 6 [M＋H－CH3]+、253.052 0 [M＋H－CH3OH]+、225.050 6 [M＋H－CH3OH－OH]+、149.060 9 [M＋H－C7H4O3]+、137.024 2 [M＋H－C9H8O2]+，保留時間和質譜與毛蕊異黃酮對照品信息相一致，確定該化合物為毛蕊異黃酮。C1為ESI+模式下得到/269的離子峰（R＝15.3 min），文獻報道[18]黃芪中的芒柄花素相對分子質量為268，推測/269.082 6為芒柄花素的準分子離子峰，C1比毛蕊異黃酮小16，表明C1可能為毛蕊異黃酮脫氧的代謝產物，存在質譜碎片251.169 8 [M＋H－H2O]+、225.112 6 [M＋H－CH4－CO]+、133.102 4 [M＋H－C7H4O3]+，保留時間和質譜行為與芒柄花素對照品信息相一致，確定該化合物為毛蕊異黃酮脫氧生成的芒柄花素。C2為ESI+模式下得到/255的離子峰（R＝12.6 min），文獻報道[18]黃芪中的大豆苷元相對分子質量為254，推測/255.067 7為其準分子離子峰，C2比毛蕊異黃酮少30（OCH2），存在237.170 1 [M＋H－H2O]+、209.138 3 [M＋H－H2O－CO]+等質譜碎片，根據元素組成分析，該化合物分子式為C15H10O4，準分子離子峰理論值為255.065 7，實測值為255.067 7，據此推測C2為毛蕊異黃酮脫去甲氧基生成的大豆苷元。D0為ESI+模式下得到/321的離子峰（R＝16.4 min），文獻報道補骨脂中的新補骨脂異黃酮相對分子質量為322，推測/321.112 9為新補骨脂異黃酮的準分子離子峰，存在質譜碎片/279.230 2 [M－H－C3H6]?、265.146 6 [M－H－C4H8]?，保留時間和質譜與新補骨脂異黃酮對照品信息相一致，確定D0為新補骨脂異黃酮。

圖6 (S)-異補骨脂二氫黃酮和補骨脂甲素體內代謝途徑

F0-1（R＝16.1 min）和F0-2（R＝16.6 min）均存在325、205的離子峰，文獻報道補骨脂中的()-異補骨脂二氫黃酮和補骨脂甲素相對分子質量均為324，推測/325.143 8 [M＋H]+為其準分子離子峰，存在經RDA裂解產生的碎片/205 [M＋ H－C8H8O]+，其保留時間及質譜與()-異補骨脂二氫黃酮和補骨脂甲素對照品相一致，確定F0-1和F0-2分別為()-異補骨脂二氫黃酮和補骨脂甲素，前者取代基在C-8位，后者取代基在C-6位，二者僅取代基位置不同，因此在體內的代謝途徑較為相似，均可發生氧化、環氧化、硫酸結合等反應。

3.5 香豆素類成分代謝產物鑒定及代謝途徑分析

補骨脂中含有的香豆素類成分補骨脂素及異補骨脂素是補骨脂藥材的質量控制成分[1]。該類原型成分及代謝產物共在大鼠體內檢測到12個，見表1，具體代謝途徑見圖7。其中，G0為ESI?模式下得到/365的離子峰（R＝8.5 min），文獻報道[19]補骨脂中補骨脂苷的相對分子質量為366，推測/365.087 3為其準分子離子峰，存在碎片/203.033 3 [M－H－C6H10O5]?、175.025 1 [M－H－C6H10O5－CO]?、159.044 0 [M－H－C6H10O5－CO2]?，根據元素組成分析，該化合物分子式為C17H18O9，準分子離子峰理論值為365.087 3，實測值也為365.087 3，且保留時間和質譜與補骨脂苷對照品一致，確定該化合物為補骨脂苷。苷類成分在體內酶的作用下會脫去糖苷轉化為苷元。G1為ESI+模式下得到/187的離子峰（R＝13.6 min），文獻報道補骨脂中補骨脂素的相對分子質量為186，推測/187.038 8為其準分子離子峰，G1比補骨脂苷少180（C6H12O6），同樣存在/159的質譜碎片，推測G1為補骨脂苷脫糖基后的苷元，其保留時間和質譜與補骨脂素對照品一致，確定該化合物為補骨脂素。補骨脂中香豆素類成分補骨脂苷、異補骨脂苷在體內存在轉化現象[20-21]，但由于其含量較高，補骨脂苷、異補骨脂苷及其苷元原型在血漿、膽汁、尿液及糞便樣品中均可檢測到。補骨脂苷在體內主要發生脫糖反應，其苷元補骨脂素可發生氧化、還原、硫酸結合、葡糖醛酸結合等反應。

圖7 香豆素類成分體內代謝途徑

3.6 皂苷類成分代謝產物鑒定及代謝途徑分析

黃芪皂苷類成分是黃芪藥材及飲片的質量控制成分。本實驗中H0為ESI+模式下得到/785的離子峰（R＝15.0 min），文獻報道黃芪中黃芪甲苷的相對分子質量為784[22]，推測/785.464 1為其準分子離子峰，存在碎片491.383 9 [M＋H－C6H10O5－C5H8O4]+、473.363 0 [M＋H－C6H10O5－C5H8O4－H2O]+、455.354 3 [M＋H－C6H10O5－C5H8O4－2H2O]+、437.339 5 [M＋H－C6H10O5－C5H8O4－3H2O]+、419.331 8 [M＋H－C6H10O5－C5H8O4－4H2O]+，其保留時間及質譜與黃芪甲苷對照品一致，據此確定H0為黃芪甲苷。H1為ESI＋模式下得到/513的離子峰（R＝17.0 min），文獻報道黃芪中環黃芪醇相對分子質量為490，推測/513.358 2為其加鈉準分子離子峰，存在碎片455.349 7 [M＋H－H2O]+、437.337 5 [M＋H－2H2O]+、419.330 0 [M＋H－3H2O]+，根據元素組成分析，該化合物分子式為C30H50O5，準分子離子峰理論值為513.355 6，實測值為513.358 2，據此推測該化合物為環黃芪醇，見表1，代謝途徑見圖8。

4 討論

BHC體外化學物質分析結果顯示，其主要含有黃酮類、單萜類、酚酸類、香豆素類、皂苷類等成分[8]。本實驗采用UPLC-Q-TOF-MS技術，在正、負離子模式下，分別檢測連續3 d ig BHC后大鼠血漿、膽汁、尿液、糞便樣品中原型成分及其代謝產物。結果顯示，BHC含有的上述5種類型成分在大鼠體內多可檢測到其原型或代謝產物，如黃芪中的黃酮類及皂苷類成分、赤芍中的酚酸類及單萜類成分、補骨脂中的黃酮類及香豆素類成分。與體外物質相比，體內原型成分數量相對較少，但代謝產物及途徑豐富。共鑒定原型成分及其代謝產物67個，其中來源于黃芪18個、赤芍17個、補骨脂32個，其代謝途徑包括氧化、還原、甲基化、葡糖醛酸結合、硫酸結合等I相及II相代謝反應。

圖8 黃芪甲苷體內代謝途徑

已有研究表明，酚酸類成分在機體內主要以II相結合形式被代謝，亦有部分首先發生I相代謝，在I相轉化的基礎上進一步進行II相結合反應[23]。有研究顯示ig沒食子酸后，沒食子酸代謝物3--甲基沒食子酸和4--甲基沒食子酸為血中主要成分，且原型和代謝物主要經尿液和糞便排泄[24]。本實驗中沒食子酸主要代謝途徑為甲基化、硫酸結合等II相反應，與文獻報道一致。

芍藥苷等單萜類成分是赤芍藥材中的主要活性成分，具有良好的抗炎、免疫調節、抗抑郁、抑制肺纖維化作用[25-28]。研究表明，芍藥苷和芍藥內酯苷在大鼠血漿和人血漿中蛋白結合率較高，提示血漿中游離藥物濃度較低[29]，且在體內主要以I相代謝為主，生成單氧化、雙氧化、甲基化、去苯甲酰基的代謝產物，該報道與本實驗結果一致。

毛蕊異黃酮苷在黃芪藥材中含量較高[30]，前期藥動學實驗結果顯示其吸收入血的濃度較低，消除速率較快[12]。也有文獻報道，黃芪藥材中毛蕊異黃酮苷和毛蕊異黃酮口服生物利用度均較低[31]，推測毛蕊異黃酮苷主要以其代謝產物形式在體內發揮藥效。本實驗各生物樣品中均未檢測到毛蕊異黃酮苷原型成分，但其代謝產物種類豐富，在尿液和糞便中檢測到其脫糖基化產物毛蕊異黃酮，進而生成脫氧、去甲基化、葡糖醛酸結合、硫酸結合等代謝物，為該推論提供佐證。此外，各生物樣品中也未檢測到芒柄花苷，但其代謝產物芒柄花素廣泛存在于膽汁、尿液和糞便中，推測芒柄花苷消除速率較快，導致其主要以代謝產物形式存在于體內。補骨脂藥材中黃酮類成分種類較多，本實驗中其葡糖醛酸結合產物大多經膽汁排泄，推測代謝產物含量較高時可能會引起腸-肝循環，延長原型化合物在體內的循環時間，進而提高其生物利用度。

補骨脂中香豆素類原型成分補骨脂苷、補骨脂素、異補骨脂苷、異補骨脂素在大鼠血漿、膽汁、尿液及糞便樣品中均可檢測到。前期藥動學研究[12]顯示補骨脂苷、異補骨脂苷等成分在體內半衰期較長，因此本實驗設計連續ig 3 d，檢測樣品中代謝產物生成情況，可有效避免因半衰期較長導致代謝不充分的情況。有文獻報道香豆素類成分的代謝主要在肝臟內進行，發生氧化、脫氫、脫甲基、內酯環開環等I相代謝反應，隨后進行II相代謝生成硫酸結合、葡糖醛酸結合等產物，代謝物大多經膽汁及尿液排出[32]，與本實驗結果一致。

黃芪皂苷類成分是黃芪藥材多種藥理活性的物質基礎[33-35]，但其生物利用度低的問題一直廣受關注。前期對BHC入血成分的藥動學研究中未檢測到黃芪皂苷類成分。本實驗中僅檢測到黃芪甲苷、環黃芪醇及去甲基產物，且僅存在于糞便樣品中，表明皂苷類成分吸收入血情況較差，大多經糞便排出體外，推測黃芪中皂苷類成分可能參與了機體腸道菌群的結構調節，也可能在腸道菌群的作用下發生生物轉化反應。

目前對于BHC藥動學研究主要聚集于其原型成分[12,36-37]，這也是多數中藥成分體內代謝研究的共性問題。原型成分因溶解度低、首過效應、酶降解或腸腔降解等因素代謝為其他成分，導致原型成分生物利用度低，多數以代謝物的形式在體內發揮藥效。因此，只研究原型成分在體內的代謝規律較為片面，應加強對中藥成分中代謝產物的鑒定分析，并進一步針對代謝產物進行藥動學研究，以實現全面評價各成分在體內的代謝規律，為闡明中藥功效物質基礎提供支撐。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Metabolite identification and metabolic pathway analysis of Bufei Huoxue Capsules in rats

REN Hui1, GUO Sheng1, ZHANG Yi-ying1, LI Quan2, WANG Heng-bin2, GENG Wan-li3,QIAN Da-wei1, DUAN Jin-ao1

1. National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, and Jiangsu Key Laboratory for High Technology Research of Traditional Chinese Medicine Formulae, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Leiyunshang Pharmaceutical Co., Ltd., Suzhou 215003, China 3. Guangdong Leiyunshang Pharmaceutical Co., Ltd., Yunfu 527300, China

To study the prototype components and metabolites of Bufei Huoxue Capsules (補肺活血膠囊, BHC) in plasma, bile, urine and feces of rats, and summarize the metabolic rules of different types of compounds.After ig BHC, the plasma, bile, urine and feces samples of rats were collected and pretreated. The prototype components and metabolites were analyzed and identified in positive and negative ion modes by ultra-high performance liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS) with mass loss filtration techniques.A total of 67 prototypes and metabolites were detected, such as gallic acid, paeoniflorin, calycosin, neobavaisoflavone, isobavachin and psoralenoside, etc. Among them, there were 10 phenolic acids, seven monoterpenes, 35 flavonoids, 12 coumarins and three saponins. The main metabolic pathways included oxidation, reduction, methylation, glucuronic acid binding, sulfuric acid binding and so on.This study preliminarily clarified the metabolites and transformation characteristics of BHC in rats, which laid a foundation for revealing its pharmacodynamic substance basis based onprocess, and provided a scientific basis for its safe clinical use.

Bufei Huoxue Capsules; metabolite identification; metabolic pathway analysis; UPLC-Q-TOF-MS; gallic acid; paeoniflorin; calycosin; neobavaisoflavone; isobavachin; psoralenoside; astragaloside IV

R284.1

A

0253 - 2670(2023)04 - 1051 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.04.005

2022-06-20

國家自然科學基金項目（81873189）；江蘇省高校自然科學研究重大項目（18KJA360006）；江蘇省“六大人才”高峰項目（YY-026）；江蘇省研究生科研與實踐創新計劃項目（KYCX21_1728）

任 慧，碩士研究生，研究方向為中藥分析與生物藥劑學。E-mail: rh_whale@163.com

郭 盛，副研究員，從事中藥資源化學與功效物質基礎研究。E-mail: guosheng@njucm.edu.cn

[責任編輯 王文倩]