血漿微小RNA miR-148b 聯合CEA與MMP-1對食管癌的診斷價值研究

李瑋浩 溫豐標 崔廣暉

食管癌作為全世界范圍內具有很高發病率且患者通常預后較差的癌癥之一，而我國食管癌人數約占全球數量的一半，特別是在河北等地區的發病率最高。盡管的斷食管癌及后期治療在臨床上取得了不錯的進展，但多數患者治療后的預期并不能讓人滿意。檢測食管上脫落的細胞是篩查食管癌額重要手段之一，但因其具有一定的創傷性，無法在廣大人群篩選使用。尋找穩定、可靠且無創的早期篩查指標已成為食管癌診療中亟待攻克的難題之一。

微小RNA(microRNA，miR)是一類長度約為22核苷酸的非編碼RNA，通過調控并參與人體的各個生理及病理相關過程，并與腫瘤的增殖、侵襲及轉移密切相關[1-2]。近年有報道指出miR-148b參與多個消化道腫瘤發生、發展，如肝癌患者體內miR-148b存在異常表達，且與肝癌的增殖、轉移和侵襲等過程密切相關[3]。癌胚抗原(CEA)是一個較廣譜的腫瘤標志物，已被證實在食管癌中有異常表達。基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)作為人體中的水解細胞外基質的酶，參與調控腫瘤細胞生長轉移等過程[4]。馬新義等[5]指出，MMP-1蛋白水平在食管鱗狀類細胞癌中高，且MMP-1水平與食管鱗狀類細胞癌的浸潤深度、淋巴結轉移和臨床分期相關，可作為判斷食管鱗狀細胞癌惡性生物學行為的重要參考指標。本研究通過對比健康人群與食管癌體內的miR-148b、MMP-1與CEA水平差異，分析這些指標和食管癌臨床病理特征間的關系及在食管癌的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2018年6月至20121年6月治療的90例食管癌患者為觀察組，男女比例為58∶32，平均年齡在(52.2±4.3)歲；食管癌位置中上段為15例，中段為52例，下段為23例；食管癌中20例為早期患者，70例為中晚期患者；78例為鱗癌，7例為腺鱗癌，5例為腺癌；16例為低分化,64例為中分化，10例為高分化。患者全部是第一次住院并經過內鏡確診。依據患者的病理學資料評估其食管癌具體的分化情況，分期則依據患者的影像學檢查、臨床特點和內鏡下結果予以判斷。對照組為同期在我院實施體檢的100例健康成年人，男女比例為62∶38，平均年齡在(52.9±3.8)歲。全部的對象均排除其他臟器惡性腫瘤，合并糖尿病，伴有自身免疫性疾病或心腦血管疾病。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 資料采集與樣本檢測

由專業研究人員對受試者性別、年齡等一般信息進行記錄。受試者在入院當天由專業的護士采用抗凝管采集10 ml靜脈血，采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)方式測定血漿中的miR-148b和GAPDH內參基因濃度；操作步驟嚴格按照說明書實行，反應總體系為：20 μl，其中上下游的引物均為0.8 μl，Mix 10 μl，cDNA為 2 μl，最后添加6.4 μl DEPC。循環條件設置為：95 ℃條件下5 min變性；接下來進行45個循環(95 ℃條件下30 s，60 ℃條件下30 s，72 ℃條件下30 s)，每組增加復孔3個。檢測過程中所用引物序列如下：miR-148b上游引物：5'-TACAACCACTGCACTACCTG-3'，下游引物：5'-TGGAATGCTTGAAGGCTGCT-3'；GAPDH 上游引物：5'-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3'，下游引物：5'-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3'。 采用2-ΔΔCt法將miR-148b相對的表達量計算出來，△Ct值=樣本和內參基因的Ct值之差。

應用化學發光法和酶聯免疫吸附法(ELISA)測定MMP-1、CEA 的濃度，其中CEA為化學發光法(上海百蕊生物科技有限公司)；腫瘤的高、低值質控品則購自英國朗道公司，質控的評估標準則依據Westgard分析。

MMP-1為酶聯免疫吸附法(ELISA)測定。全部標本稀釋100倍后分別加入微孔板，然后加抗體在室溫情況下予以40 min孵育(分別加10 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL濃度的3個標準品以及陽、陰性對照)，5次洗板后，在避光情況下加具有酶標記的單抗在室溫情況下40 min孵育，接下來5次洗板，加入底物等待15民的反應后在終止，于Nanodrop ND 2000型分析儀(購自美國賽默飛世爾公司)分析吸光值(A)。

分別計算血漿miR-148b、MMP-1和CEA的批內、批間變異系數(CV)情況，用以判定本次操作的精確度及重復性。

1.3 試劑與儀器

實驗過程中用到的儀器以及試劑由：H-1850R型的4 ℃離心機(購自中國湘儀集團)；C1000型的RT-qPCR儀(購自美國Bio-Rad公司)；逆轉錄試劑盒(批號： 16072513，中國Takara公司)；提取血漿RNA的試劑盒(批號：BC1814115OA，購自中國Bioteke公司)；RSV1型的PCR儀(購自美國 Bio-Rad公司)；SYBR Green Mixture(批號：MIC102608，中國康為世紀公司)；UniCel DxI 800型的生化分析儀(購自美國貝克曼庫爾特公司)。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 兩組血清miR-148b、MMP-1與CEA表達水平對比

觀察組與對照組間的性別、年齡、吸煙史等均無差異(P>0.05)。觀察組血清miR-148b、CEA和MMP-1水平均較對照組高，且差異明顯(P<0.05)，見表1。血清miR-148b、CEA和MMP-1檢測的批內CV值是3.7%、2.9%和4.5%，批間CV值是3.9%、3.3%和4.6%，均小于5%，表明本次操作的精確度、重復性較好。

表1 兩組一般資料及血清miR-148b、CEA與MMP-1水平比較

2.2 miR-148b、CEA與MMP-1水平與食管癌臨床病理特點的關系

食管癌血漿miR-148b與MMP-1水平與其分化程度、分期和組織學類型呈明顯相關性(P<0.05)。且miR-148b與MMP-1水平在食管腺鱗癌、中晚期食管癌和低分化患者中上升最明顯，而血漿CEA與食管癌分化程度、分期和組織學類型無關(P>0.05)。此外三者與食管癌患者的性別、年齡、飲酒史等均無相關性(P>0.05)，見表2。

表2 血漿miR-148b、CEA與MMP-1水平與食管癌臨床病理特征的關系

2.3 血漿miR-148b、CEA與MMP-1水平對食管癌的鑒別診斷

ROC曲線結果發現，血漿miR-148b、CEA與MMP-1在區分食管癌與非食管癌的AUC分別是0.890(95% CI：0.852～ 0.921，P<0.001)、0.654(95% CI：0.504～ 0.807，P=0.012)和0.814(95% CI：0.742～0.908，P<0.001)；而各個指標的約登指數處于最大值時所對應的特異度和靈敏度是：84.0%/83.2%、80.3%/32.5%和82.1%/77.6%；診斷界值是16.4、6.3 ng/ml和24.8 pg/ml。當聯合miR-148b、CEA與MMP-1時，logistics回歸將上述miR-148b、CEA與MMP-1這3個指標擬合后得到變量-“PRE-1值”，并帶入ROC曲線分析，發現聯合3種指標在區分食管癌與非食管癌的AUC為0.902(95% CI：0.850～0.964，P<0.001)，靈敏度為81.1%，特異度為92.4%，見圖1。

圖1 miR-148b、CEA與MMP-1對食管癌的鑒別診斷

2.4 miR-148b、CEA與MMP-1水平對食管癌風險的預測價值

單因素分析發現，高miR-148b、CEA與MMP-1水平是造成食管癌的危險因素。多因素結果顯示，在校正年齡、性別、飲酒、吸煙等因素影響后，高miR-148b與MMP-1水平仍是誘發食管癌的獨立危險因素，見表3。

表3 血漿miR-148b、CEA與MMP-1水平對食管癌風險的預測價值

3 討論

食管癌作為全世界范圍內比較常見的上消化系統惡性腫瘤，極大地威脅了全球人民的的健康。生物敏感標志物作為尿液、血液及組織中可以用于診斷早期疾病情況的指標，具有操作便捷、創傷小、成本低等優勢，可診斷并評估疾病具體情況[6-7]。其在人體中的濃度改變情況可以判斷疾病具體進展，最好的情況下，生物敏感標志物需要有較高的診斷早期腫瘤的敏感性及特異性，其在非腫瘤組織中濃度并不上升。顯然，挑選更多高價值的生物敏感標志物是目前臨床診斷食管癌的熱點，對早期診斷并針對性治療食管癌意義重大。

CEA是食管癌的輔助診斷指標之一，對食管癌的早期診斷有一定價值。ukaszewicz等[8]的研究發現，利用化學發光法檢測血清CEA在區分食管癌患者與健康人群中的敏感性/特異性分別為17.0%/93.0%，提示血清CEA對于食管癌診斷敏感性較低。在本次研究中，CEA區分食管癌及健康人群的敏感性/特異性分別是32.5%/80.3%，敏感性較低，與之前的報道基本一致[8]。但CEA作為食管癌診斷的傳統指標，尚存在敏感性不足的問題。

miR是新型和基因調控相關的因子，能在轉錄后將靶基因具體表達過程以及蛋白質的翻譯過程抑制，已被證明了在胃癌[9]和神經膠質瘤[10]等多種腫瘤中存在異常表達。miR-148b是近年研究發現的重要的原癌基因。高表達的miR-148b通過對直接靶基因如抑癌基因ROCK1轉錄結束后可以負性調控并抑制癌細胞凋亡，加速細胞的增殖和遷移[3]。Chen等[3]通過體外培養肝癌細胞并經脂質體轉染含有si-miR-148b的質粒，下調肝癌細胞中miR-148b的表達水平，觀察到下調miR-148b可顯著降低肝癌細胞遷移能力。然而，關于miR-148b在食管癌中的機制研究尚未見報道。在本次研究中，我們發現血漿miR-148b在食管癌患者中水平顯著高于健康女性，且在食管腺鱗癌、中晚期食管癌和低分化食管癌患者中上升最明顯，本次研究結果通過大樣本量的檢測對前期基礎研究結果進行了驗證，證實血漿miR-148b的異常表達在食管癌早期鑒別診斷及疾病進展程度具有一定價值。

國內外近年來很多的研究均證實了血漿中的MMP-1在腫瘤的微環境重塑、加速腫瘤細胞向遠處轉移和診斷并治療腫瘤中具有很高的應用價值[11-12]。早前的相關報道指出，胃癌患者血漿內的MMP-1基因表達相較于健康人群明顯上升，并濃度增加的MMP-1和胃癌細胞向遠處的轉移相關[11]。Benson等[12]研究亦發現癌組織內的MMP-1基因較癌旁組織的表達更高。這些研究都證實了MMP-1調控腫瘤發生和發展。本研究試我們第一次利用大樣本檢測食管癌患者血漿內的MMP-1表達差異大，且食管腺鱗癌、中晚期食管癌與低分化食管癌患者中的血漿MMP-1濃度上升最多，與前期的試驗相互對應[11-12]。

ROC曲線分析顯示，血漿miR-148b與MMP-1在區分子食管癌與對照組的靈敏度/特異度分別為83.2%/84.0%和77.6%/82.1%，均高于單獨應用CEA；而聯合miR-148b、CEA與MMP-1在區分食管癌和對照組特異度明顯上升，達到92.4%，提示聯合應用血漿miR-148b、CEA與MMP-1在食管癌鑒別診斷中具有較高價值。Logistic回歸多因素分析顯示，在校正性別、年齡、飲酒、吸煙等因素影響后，血漿高miR-148b和高MMP-1水平仍是食管癌發生的獨立危險因素。然而，本次研究仍有如下不足：(1)本次研究納入的患者均挑選自本院，過于集中的患者來源可能會對本次研究結果產生了偏倚的影響，今后可以從多中心的隊列進一步驗證相關的結果；(2)本研究納入90例食管癌患者，納入病例的數目仍然存在一定的限的，后期需要增加更多的樣本量進行研究證實血漿miR-148b、CEA與MMP-1在我國食管癌患者中的臨床價值。

綜上，通過本次研究我們發現聯合血漿miR-148b、CEA與MMP-1在食管癌鑒別診斷中臨床意義重大，有望為食管癌患者的診療提供新的途徑與思路。