低Tim-3表達水平與肝癌氬氦刀冷凍消融聯合TACE治療響應的相關性

張 劍 楊薈玉 張自森 王利娟 張紅巧 郭彥偉

原發性肝癌是我國常見的惡性腫瘤和第3位的腫瘤致死病因，嚴重地威脅我國人民的生命健康[1-2]。AHCS治療經皮穿刺肝癌，通過高壓氬氣的超低溫以及高壓氦氣產生的熱效應最大限度的殺傷腫瘤組織[3]。大量的研究指出， AHCS-TACE聯合治療在中晚期肝癌患者中療效更佳[4]，并且安全性較佳。但有研究指出，AHCS-TACE治療可能只在部分患者中提供明顯的生存益處。目前，在臨床實踐中尚缺乏識別AHCS-TACE聯合療法最佳響應者的生物標志物[5-6]。探索一種高特異性的生物標志物以區分AHCS-TACE聯合治療響應良好的患者，能夠顯著的改善中晚期肝癌的治療效果，并降低患者的醫療成本，具有重要的臨床意義。Tim-3表達于腫瘤浸潤免疫細胞中，參與調節免疫細胞對腫瘤的免疫殺傷效應[7]。有研究指出免疫殺傷效應在AHCS-TACE聯合療法的抗腫瘤效應中扮演關鍵角色[8]。此外，臨床研究指出Tim-3的表達含量上升與患者的疾病進展以及不良預后顯著相關[9]。在本次研究中，我們探索了免疫細胞表面Tim-3表達含量與AHCS-TACE聯合治療響應的相關性，以期為TACE+AHCS聯合治療的患者提供一種高特異性的生物標志物，從而實現療效不佳的患者進行提早區分以及個體化治療從而改善患者的預后。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年11月至2020年11在我院接受TACE-AHCS聯合治療的肝細胞癌患者共102例。本研究的納入標準為：①患者年齡在18～75歲之間；②根據EASL或AASLD指南確診為診斷為肝細胞癌；③BCLCB或C期，不具備手術切除或移植的候選資格；④Child-Pugh A或B級；⑤腎功能正常(血清肌酐濃度1.5倍或低于正常范圍的上限)；⑥ECOG評分為0～2分。排除標準：①門靜脈主干完全被癌栓栓塞；②有肝臟切除或肝臟移植史；③接受過靶向治療或全身性的化療。在接受治療前，進行腫瘤活檢，對腫瘤樣本進行免疫組化檢測腫瘤浸潤淋巴細胞中Tim-3蛋白表達水平。腫瘤浸潤淋巴細胞上Tim-3蛋白陽性率>5%，被定義為Tim-3高表達。102例患者，根據Tim-3蛋白陽性率是否>5%，分為Tim-3高表達組以及Tim-3低表達組。本研究已被我院倫理道德委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 治療方法

TACE的治療方法如文獻所示[10]，這里簡述如下：由三位介入科醫生進行介入治療。置入5-Fr YASHIRO或RH導管，并進行內臟血管造影以評估肝動脈供應。將2.7-F微導管置入合適位置，并緩慢注射5～20 ml脂碘醇與20～40 mg表柔比星，直到血流減慢。最后，必要時注射350～560 μm的聚乙烯醇顆粒，以減少腫瘤血流。動脈化療栓塞術后14天，復查血常規、凝血常規及肝腎功，復查CT觀察碘油沉積情況，排除禁忌證后，簽署知情同意書后行超聲聯合CT引導下氬氦刀冷凍消融治療。手術由CT掃描引導。應用氬氣低溫消融系統和17號冷凍消融針進行。使用1至5個冷凍消融針，以實現冰球完全覆蓋腫瘤，隨后重復CT掃描觀察消融范圍，確保冰球邊界超過靶區邊緣5 mm以上，關閉氬氣并切換氦氣復溫至20 ℃以上，再次重復以上氬氣冷凍-氦氣復溫循環；5 min后復查胸腹部CT，觀察有無胸腔及腹腔出血。術后給予生命體征監測、保肝、補液及對癥支持治療5～7天。視復查情況間隔4～6周重復以上治療過程。

1.3 觀察指標

所有患者均通過門診復查或電話隨訪至2021年11月，隨訪時間為12～60個月，平均(34±11)個月，記錄患者疾病復發及生存情況。本次研究的主要終點包括：總生存期(OS)，定義為從第一次TACE治療開始到死亡或最后一次隨訪的時間。次要終點包括腫瘤反應和腫瘤進展時間(TTP)，腫瘤進展時間是指從第一次TACE治療開始到放射性腫瘤進展、死亡或最后一次隨訪的時間。腫瘤評價指標包括客觀反應率(ORR)，包括完全反應(CR)和部分反應(PR)病例。入院時對并發癥進行臨床觀察，出院后通過電話訪談進行評估。

1.4 T淋巴細胞亞群水平檢測

在治療后應用ELISA實驗方法檢測所有患者T淋巴細胞亞群水平，包括CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平，T淋巴細胞亞群檢測試劑盒購自美國abcam公司，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.5 統計學分析

所有統計分析均使用SPSS 23.0版軟件進行。2組之間的連續變量用mean±SD表示，組間比較采用t檢驗。分類變量用百分比和頻率表示，并使用χ2檢驗進行比較。生存曲線用Kaplan-Meier方法構建，組間生存差異分析采用Log-rank檢驗用對數秩檢驗進行比較。使用Cox's回歸模型進行各種參數的單變量和多變量分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 2組患者一般資料比較

本次研究Tim-3低表達患者54例，Tim-3高表達患者48例。2組患者在性別、ECOG評分、Child-Pugh分級、腫瘤大小、AFP水平、有無門靜脈侵犯相關指標均無統計學差異。見表1。

表1 2組患者一般資料(例，%)

2.2 2組患者客觀緩解率對比

治療3月之后，Tim-3低表達組患者的ORR為74.1%，Tim-3高表達組患者的ORR為39.6%，Tim-3低表達組患者對TACE-AHCS聯合治療的響應優于Tim-3高表達組患者，數據比較差異具有統計學意義(χ2=4.177,P<0.05)，如表2所示。

表2 2組患者ORR比較(例，%)

2.3 2組患者中遠期療效對比

2組患者均進行了為期3年的隨訪，在最后一次隨訪中，Tim-3低表達組患者和Tim-3高表達組分別有14例以及5例患者存活。Tim-3低表達組的中位OS為27.07月，Tim-3高表達組為19.79個月，2組差異具有統計學意義(χ2=21.714，P<0.05)。Tim-3低表達組的中位TTP為16.41個月，而Tim-3高表達組為11.49個月，數據比較差異具有統計學意義(χ2=22.886，P<0.05)。見圖1。

圖1 2組患者中遠期療效比較

2.4 2組患者治療后T淋巴細胞亞群水平比較分析

TACE-AHCS聯合治療3月后，Tim-3低表達組患者的CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T細胞水平均顯著高于Tim-3高表達組患者，數據比較差異具有統計學意義(P<0.05)，如表3所示。

表3 2組患者治療3月后T淋巴細胞亞群水平

2.5 2組患者中遠期療效的預后因子分析

單因素分析顯示，有無腹水、有無門靜脈瘤栓、肝內腫瘤最大直徑、腫瘤生長方式以及Tim-3表達含量與OS和TTP顯著相關(P<0.05)，此外，多因素分析顯示，有無門靜脈瘤栓和肝內腫瘤的最大直徑以及Tim-3表達含量是OS和TTP的統計學意義上的預后因素(P<0.05) ，如表4、5所示。

表4 影響患者TTP的預后因子分析

表5 影響患者OS的預后因子分析

3 討論

原發性肝癌是第4位的常見惡性腫瘤和第3位的腫瘤致死病因。盡管在過去的幾十年里已經開發了各種治療方法，但晚期肝癌的預后仍然很差[11]。目前的研究評估了TACE聯合冷凍消融，研究指出聯合組的完全緩解率和總有效率明顯高于TACE組[4]。TACE聯合AHCS可以為不可切除的HCC患者帶來更多益處。聯合治療的效果明顯優于單獨的TACE或AHCS，且無重大并發癥發生。然而，TACE聯合AHCS治療可能只有部分患者受益，但目前尚缺乏識別良好響應患者的生物標志物。

本研究評估了Tim-3低表達組以及Tim-3高表達組患者對TACE聯合AHCS治療的響應程度，及其對患者預后的意義。Tim-3低表達組以及Tim-3高表達組的中位OS(27.07月VS.19.79月，P=0.0001)和中位TTP(16.41月VS.11.49月，P=0.001)具有統計學差異。此外，多因素分析顯示，有無門靜脈瘤栓的存在和肝內腫瘤的最大直徑以及Tim-3表達含量是OS和TTP的統計學意義上的預后因素。此項研究的研究結果表明，Tim-3表達含量可以作為肝癌患者對TACE聯合AHCS治療的預測因子。

Tim-3是一個較少被研究的免疫檢查點分子，在調節免疫反應和誘導免疫耐受方面發揮著重要而復雜的作用。在部分肝癌患者肝癌組織的腫瘤細胞、腫瘤浸潤T細胞、Tregs和TAMs中已經發現Tim-3的異常表達[12-13]。有研究指出，Tim-3的高表達與肝癌患者的預后顯著相關。例如，Hastings等[14]研究發現，HCC組織中Tim-3+腫瘤浸潤性T細胞的數量越多，患者的生存期越短。此外，Tim-3在外周血單核細胞中的表達可用于預測治療性肝切除的HCC患者的復發[15]。復發性HCC患者在肝臟切除前后，外周血單核細胞中Tim-3+ CD4+T細胞和Tim-3+ CD8+T細胞的比例明顯高于非復發性HCC患者。然而，目前探討肝癌中Tim-3表達含量對患者治療響應的研究較少。

在本次研究中，我們的研究結果指出，在治療后與Tim-3低表達組相比，Tim-3高表達組患者CD8+T細胞水平顯著降低。CD8+T細胞是發揮抗腫瘤功能的TILs的最重要組成部分。HCC中大量的CD8+TILs與合理的預后相關，包括改善OS、延長無復發生存期和延緩疾病進展[16]。CD8+細胞毒性T淋巴細胞可以直接接觸并通過穿孔蛋白和顆粒酶裂解靶細胞，或通過Fas/FasL信號傳導和分泌IFN-γ和TNF誘導靶細胞凋亡。Zhou G等[17]證明，Tim-3+的CD8+T細胞顯示出最低水平的顆粒酶B、IFN-γ和TNF-α，此外機制研究指出，Tim-3與其配體Gal-9接觸能夠促CD8+T細胞耗竭。

此外，本研究結果表明，在治療后與Tim-3低表達組相比，Tim-3高表達組患者CD4+T細胞水平顯著降低。CD4+T細胞在HCC中發揮著從效應細胞功能到調節細胞功能的截然不同的作用[18]。CD4+Th1細胞在抗原刺激下產生高水平的IFN-γ和TNF-α，負責細胞介導的對細胞內病原體和腫瘤細胞的免疫[19]。有研究指出，Tim-3能夠介導Th1細胞凋亡，Th1細胞的喪失能夠促進肝癌的疾病進程生長[20]。這些研究均揭示了Tim-3高表達組患者預后較差的可能機制。

綜上所述，Tim-3低表達組患者可能對TACE+AHCS聯合治療響應更好，治療前，腫瘤浸潤免疫細胞中Tim-3含量對TACE+AHCS聯合治療患者預后具有預測價值。基于Tim-3的高表達模式，應用Tim-3的免疫檢查點抑制劑進行維持治療，可能會改善接受TACE+AHCS聯合治療的患者的預后和完全反應率。