五味子素通過調控FOXC1基因對結直腸癌細胞惡性生物學行為的作用機制

許亞坡 羅金鍵 夏 超 吳慧麗

全球范圍內結直腸癌(colorectal cancer，CRC)每年新發病例數約180萬，死亡人數約88萬[1]，而近年我國CRC患病率及死亡率呈上升趨勢，患病率居惡性腫瘤第三位，死亡率居第五位[2]，嚴重威脅國民生命健康。手術是治療早期CRC的有效手段，但進展、轉移等階段的CRC患者，生存情況不容樂觀，分子靶向機制是現階段臨床研究重點[3]，故而探尋有效的基因治療靶點藥物對患者生存有積極意義。五味子素來源于五味子中分離的木脂素類活性成分，具有抗炎、神經保護、調節細胞代謝等多種藥理作用[4]，近年研究表明其在腫瘤抑制方面顯示出確切效果[5]。另有研究發現，叉頭框轉錄因子C1(Forkhead boxC1，FOXC1)作為插頭框轉錄因子家族重要一員，與癌細胞分化、發育等過程密切相關，上調其水平可促進CRC癌細胞增殖[6]。但目前關于五味子素對CRC細胞增殖、侵襲及調控FOXC1基因的機制尚未明確，本研究以CRC HCT116細胞為研究對象，探討五味子素對HCT116細胞的影響，并進一步分析其作用機制，為臨床CRC治療提供參考依據。報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人CRC HCT116細胞，購自上海匹拓生物科技有限公司。

1.1.2 試劑與儀器 RPMI-1640培養基購自上海微科生物技術有限公司，Opti-MEM培養基購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；細胞計數試劑盒-8(CCK-8)購自上海澤葉生物科技有限公司，LipofectamineTM 2000試劑盒及Trizol溶液來自北京索萊寶科技有限公司，Transwell chamber購自廣州賽哲科技有限公司；五味子素、DEPC購自Sigma-Aldrich(上海)貿易有限公司，Binding Buffer緩沖液購自上海君瑞生物技術有限公司，膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)購自北京冬歌博業生物科技有限公司，碘化丙啶(PI)及0.1%結晶紫購自上海麥克林生化科技有限公司，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE)購自上海群己生物科技有限公司；FOXC1、FOXC1-NC(模擬物陰性對照)均購自美國Sigma-aldrich公司；FOXC1(ab227977)、E-cadherin(ab16663)、MMP2(ab92536)、Vimentin(ab92547)抗體購自美國Abcam公司；Varioskan LUX型酶標儀購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，流式細胞儀(美國BD公司，FACSCalibur型)，Avanti J-E離心機購自美國貝克曼庫爾特有限公司，Powerpac Universal型電泳儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人CRC HCT116細胞，生長于含10%滅活胎牛血清、100 U/ml鏈霉素及青霉素的RPMI-1640培養基，將培養基置于5% CO2、37 ℃的飽和溫度培養箱中，每2～3 d使用0.25%胰蛋白酶消化及傳代細胞1次，采用10% DMSO+90%血清凍存液來凍存細胞，用于后續實驗操作。

1.2.2 CCK-8檢測CRC HCT116細胞增殖 取對數生長期HCT116細胞，接種于96孔板(每孔2×104個)，分別添加0、12.5、25、50 μmol/L濃度的五味子素(甲醇溶解)，每個濃度設置5個復孔，將HCT116細胞在培養箱(5% CO2、37%)中分別培養12 h、24 h、48 h，細胞貼壁丟棄培養基，再添加10 μl CCK-8與200 μl培養基，37 ℃孵育2 h，490 nm波長下使用酶標儀測定吸光度值，計算不同濃度下細胞存活率，明確細胞增殖情況，重復3次，取平均值。并選擇細胞存活率接近50%的五味子素濃度進行后續實驗研究。

1.2.3 細胞轉染與分組 隨機分層法分為5組：對照組、FOXC1-NC組、FOXC1組、五味子素組、FOXC1+五味子素組。轉染前24 h，取長勢良好對數生長期HCT116細胞，倒置顯微鏡，觀察細胞增殖至60%～70%時，進行胰蛋白酶消化，收集CRC HCT116細胞，PBS重懸，調整細胞密度，以1×106個/ml接種到24孔板，每組設置5個復孔，每個復孔重復3次，之后進行細胞轉染：使用相關基因序列質粒(2.4 μl的FOXC1-NC及FOXC1)與5 μl的LipofectamineTM2000分別添加至245 μl的Opti-MEM培養基中，制成溶液備用，靜置5 min后，混勻，靜置30 min，37 ℃繼續培養(48 h)，熒光顯微鏡下觀察轉染率，轉染成功標準為轉染率>85%，以便用于后續實驗。對照組不做任何處理，FOXC1-NC組轉染FOXC1-NC，FOXC1組轉染FOXC1，五味子素組HCT116細胞內加入50 μmol/L五味子素，FOXC1+五味子素組穩定轉染FOXC1 24 h后加入五味子素50 μmol/L。

1.2.4 流式細胞儀測定HCT116細胞凋亡情況 取HCT116細胞，添加預冷PBS緩沖液，離心6 min(4 ℃，1000 r/min，離心半徑10 cm)，棄上清液，再次加入預冷PBS緩沖液，離心(離心條件同上)，棄上清液，加入500 μl 1×Binding Buffer緩沖液來重懸細胞，之后依次加入5 μl Annexin V-FITC、10 μl PI，室溫下振蕩孵育，使用流式細胞儀測定細胞凋亡情況，CELL QUEST 3.0分析實驗數據。

1.2.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 預冷培養液，以1∶8比例稀釋Matrigel基質膠與培養基，加入Transwell chamber上室(40 μl/孔)，培養箱孵育(37 ℃，5 h)，選取對數期HCT116細胞，加入Transwell chamber上室，每孔3×104個，將100 g/L胎牛血清培養液加入Transwell chamber下室，每孔600 μl，培養箱培養24 h(37 ℃)，PBS緩沖液洗滌，棉簽擦去微孔膜內層磁暴，多聚甲醛固定(20 min)，PBS清洗，0.1%結晶紫染色(10 min)，洗去表面結晶紫，選10個視野，顯微鏡下計算侵襲至微孔膜下層的細胞數，重復3次實驗，取平均數。

1.2.6 Realtime-PCR測定FOXC1、E-cadherin、MMP2、Vimentin mRNA表達 收集各組培養48 h的HCT116細胞，PBS緩沖液沖洗2次，吸盡PBS溶液后，予以Trizol溶液1 ml震蕩混勻(4 ℃，5 min)，加入0.2 ml氯仿振蕩15 s，靜置(4 ℃，3 min)，離心(4 ℃，12000 rpm，15 min)，取上層水相至離心管，加入等體積異丙醇，-20 ℃靜置20 min，離心(4 ℃，12000 rpm，15 min)，棄上清，1 ml DEPC處理后洗滌沉淀，離心機離心(4 ℃，8000 rpm，185 min)，加入dd H2O水30 μl，溶解RNA；RNA逆轉錄合成cDNA，以逆轉錄cDNA為模板，進行PCR擴增，引物序列如表1，反應體系如下：總反應體系10 μl，2 μL模板cDNA ，各1 μl上下游引物，擴增條件(98 ℃反應5 min，95 ℃變性15 s，72 ℃延伸30 s，熔解曲線55 ℃～95 ℃，40個循環)；以β-actin為內參，目的基因相對定量采用2-△△CT法計算。

表1 引物序列

1.2.7 Western blot檢測FOXC1、MMP2、E-cadherin、Vimentin蛋白表達 取各組細胞，加入蛋白裂解液，混勻，充分裂解20～30 min，提取蛋白質，之后予以離心(12000 r/min，離心半徑10 cm，5 min)，取上清液，SDS-PAGE電泳，電轉緩沖液轉膜(50 min)，轉移蛋白至硝酸纖維素膜上，將其放入50 g/L脫脂奶粉中，孵育2 h，TBST洗膜5 min，在加入稀釋(1∶1000)的FOXC1、MMP2、E-cadherin、Vimentin一抗與稀釋(1∶2000)的β-actin一抗中孵育過夜(4 ℃)，次日洗膜，加入稀釋(1∶2000)二抗孵育(室溫，1 h)，洗膜，暗室中曝光顯影，凝膠成像系統掃描，Image J 軟件分析灰度值，計算相對表達量：目的蛋白/內參β-actin灰度值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 不同濃度五味子素對HCT116細胞存活率的影響

使用不同濃度五味子素作用于HCT116細胞，檢測不同時間點細胞存活率，結果發現，與0 μmol/L五味子素處理HCT116細胞比較，在12 h、24 h、48 h時采用12.5、25、50 μmol/L五味子素處理的細胞存活率逐漸降低(P<0.05)，其中采用50 μmol/L五味子素處理48 h時，細胞存活率最接近50%，后續實驗均選取此條件細胞。見圖1。

圖1 不同濃度五味子素處理不同時間的HCT116細胞存活率

2.2 各組細胞凋亡率比較

5組細胞凋亡率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；兩兩比較結果顯示，與對照組、FOXC1-NC組比較，FOXC1組細胞凋亡率降低(P<0.05)；與對照組比較，五味子素組細胞凋亡率升高(P<0.05)；FOXC1+五味子素組細胞凋亡率高于FOXC1組，低于五味子素組(P<0.05)。見表2。

表2 各組HCT116細胞凋亡率比較

2.3 各組細胞侵襲能力比較

5組侵襲細胞數比較，差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組、FOXC1-NC組比較，FOXC1組侵襲細胞數升高(P<0.05)；與對照組比較，五味子素組侵襲細胞數下降(P<0.05)；且FOXC1+五味子素組侵襲細胞數低于FOXC1組，高于五味子素組(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組HCT116細胞侵襲細胞數比較

2.4 FOXC1、E-cadherin、MMP2、Vimentin mRNA表達水平

5組HCT116細胞FOXC1、E-cadherin、MMP2、Vimentin mRNA表達比較，差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組、FOXC1-NC組比較，FOXC1組FOXC1、MMP2、Vimentin mRNA表達水平升高，E-cad-herin mRNA表達水平下降(P<0.05)；與對照組比較，五味子素組FOXC1、MMP2、Vimentin mRNA表達水平降低，E-cadherin mRNA表達水平升高(P<0.05)；FOXC1+五味子素組FOXC1、MMP2、Vimentin mRNA表達水平低于FOXC1組，高于五味子素組，且E-cadherin mRNA表達水平高于FOXC1組，低于五味子素組(P<0.05)。見表4。

表4 各組HCT116細胞FOXC1、E-cadherin、MMP2、Vimentin mRNA表達水平

注：×200，A：對照組；B：FOXC1-NC組；C：FOXC1組；D：五味子素組；E：FOXC1+五味子素組

2.5 FOXC1、E-cadherin、MMP2、Vimentin蛋白表達水平

5組HCT116細胞FOXC1、E-cadherin、MMP2、Vimentin 蛋白表達比較，差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組、FOXC1-NC組比較，FOXC1組FOXC1、MMP2、Vimentin蛋白表達水平升高，E-cadherin蛋白表達水平下降(P<0.05)；與對照組比較，五味子素組FOXC1、MMP2、Vimentin蛋白表達水平降低，E-cadherin蛋白表達水平升高(P<0.05)；FOXC1+五味子素組FOXC1、MMP2、Vimentin蛋白表達水平低于FOXC1組，高于五味子素組，且E-cadherin蛋白表達水平高于FOXC1組，低于五味子素組(P<0.05)。見表5、圖3。

表5 各組HCT116細胞FOXC1、MMP2、Vimentin、E-cadherin蛋白表達水平

3 討論

目前研究認為CRC是環境、遺傳、飲食習慣、生活方式等多因素協同作用的結果，mi RNA基因突變或擴增，致使致癌信號激活，細胞發生惡變，產生大量利于自身生長的趨化因子，不加干預會不斷惡化、轉移，手術、化療雖可延長患者生存時間，但手術存在腫瘤分期限制，化療存在耐藥性及毒副作用，整體生存率仍有待提高[7]，因此深入探索其他CRC治療機制十分必要。

注：A：對照組；B：FOXC1-NC組；C：FOXC1組；D：五味子素組；E：FOXC1+五味子素組

五味子素來源于木蘭科植物五味子，前期學者研究發現其具有廣泛的生物活性，如有學者[8]發現，五味子素B可轉導TLR4信號，減少神經元凋亡，以保護神經；另有學者發現[9]五味子素B可增強多西他賽的抗腫瘤作用，促進細胞凋亡。隨著臨床的應用逐漸發現，五味子素系列在腫瘤方面顯示出獨特優勢，研究表明[10]五味子素A可下調miR-155水平，抑制乳腺癌細胞增殖，且有研究發現[11]五味子素B能誘導人前列腺癌細胞凋亡，具有潛在藥理作用。而五味子素對CRC細胞的凋亡、侵襲能力影響尚不清楚。本研究采用不同濃度五味子素處理CRC HCT116細胞發現，不同濃度五味子素可不同程度降低細胞存活率，提示五味子素可降低HCT116細胞活性。為進一步評估五味子素對各組HCT116細胞的凋亡、侵襲影響，本研究采用流式細胞儀測定HCT116細胞凋亡情況，Transwell實驗測定細胞侵襲能力，結果顯示，經轉染FOXC1后，細胞凋亡率低于對照組、FOXC1-NC組，侵襲細胞數高于對照組、FOXC1-NC組，提示過表達FOXC1可抑制細胞凋亡，增強細胞侵襲力；在過表達FOXC1后使用五味子素干預，發現FOXC1+五味子素組細胞凋亡率低于五味子素組，而侵襲細胞數高于五味子素組，提示五味子素抑制促進細胞凋亡及抑制細胞侵襲，可能與降低FOXC1表達有關。

FOXC1定位于染色體6p25上，是FOX家族重要一員，已被證實在肝癌、肺腺癌等多種惡性腫瘤中高表達，參與癌細胞生物學行為，與細胞遷移、侵襲、耐藥性密切相關[12-14]。Seong-Hoon Yun等[15]國外學者發現，OUP-TFII敲低可上調FOXC1表達，促進大腸癌細胞增殖與侵襲；而劉健等[16]學者研究顯示，FOXC1可直接與靶基因整聯蛋白α7、成纖維細胞生長因子受體4結合，激活其表達，促進直腸癌轉移。上述表述提示FOXC1與CRC發展進程相關，本研究進一步進行Realtime-PCR及Western blot檢測，分析各組細胞FOXC1及其下游基因mRNA、蛋白表達變化，結果發現，FOXC1組FOXC1、MMP2、Vimentin mRNA及蛋白表達水平高于對照組、FOXC1-NC組，E-cadherin mRNA及蛋白表達水平低于對照組、FOXC1-NC組，而五味子素組上述表達水平相反，而FOXC1+五味子素組則可部分逆轉五味子素對FOXC1及其下游E-cadherin、MMP2、Vimentin mRNA及蛋白表達水平，以此驗證五味子素可下調FOXC1表達，調節相關mRNA、蛋白水平，進而抑制細胞侵襲能力，促進HCT116細胞凋亡。

綜上，FOXC1在CRC HCT116細胞中高表達，促進細胞增殖，而五味子素可降低細胞活力，抑制其侵襲，可能與五味子素下調FOXC1表達及調節相關mRNA、蛋白表達有關，可為臨床基因靶向治療提供實驗依據，但本研究尚存一定局限性，需動物體實驗來驗證上述結論。