腦卒中患者氯吡格雷抵抗與CYP2C19基因多態性和P2Y12受體的相關性研究*

杜安妮，林 牧，蔡 銳

(1.遵義醫藥高等專科學校藥理教研室，貴州 遵義 563000；2.貴州航天醫院中心實驗室，貴州 遵義 563000；3.遵義市紅花崗區人民醫院，貴州 遵義 563000)

腦卒中是臨床上較常見的腦血管疾病，多發病于45 歲以上的中老年人[1]，據統計，我國現有1 100萬例腦卒中患者，每年新發約200 萬例，死亡150萬例[2]。目前，我國老齡化問題日益嚴重，腦卒中發病率呈逐年攀升趨勢[3]。在腦卒中治療過程中，常需要長期服用血小板P2Y12受體拮抗劑——氯吡格雷，用于阻礙二磷酸腺苷(ADP)介導的血小板膜糖蛋白(GP) Ⅱb/Ⅲa 復合物活化及ADP與血小板P2Y12受體的結合，以達到抑制血小板聚集、改善血流動力學的目的[4]。

在使用氯吡格雷治療過程中，部分患者會表現出低反應、無反應或耐藥性的現象，稱為氯吡格雷抵抗。在研究氯吡格雷抵抗的各種機制中發現，細胞色素P450酶同工酶系統中的CYP2C19基因是氯吡格雷代謝過程中的關鍵酶[5]。而CYP2C19基因具有高度多態性，根據藥物代謝快慢可將CYP2C19基因型分為 4 種代謝表型：超快代謝型(UM)*17/*17、 *1/*17，快代謝型(EM)*1/*1，中間代謝型(IM)*1/*2、 *1/*3，慢代謝型(PM)*2/*2、*2/*3、 *3/*3[6]。有研究發現，CYP2C19 PM患者不良心腦血管事件的發生率明顯高于EM患者[7]，PM患者體內氯吡格雷的活性轉化率降低，活性代謝產物減少，最終導致藥效減弱[7-8]。而UM*17基因在中國人群中突變頻率約為2%[9]，該基因型會導致酶活性過度表達，患者在服藥后可能會出現氯吡格雷抗血小板療效增強，進而增加其出血風險。查閱國內外相關文獻，普遍認為CYP2C19基因第681位堿基由G→A突變(CYP2C19*2)是影響氯吡格雷抗血小板聚集及療效的重要因素，個體表現為對氯吡格雷的反應性降低或無反應[10]。但僅依據CYP2C19基因型來指導臨床用藥并不一定能達到較為滿意的治療結果。

已有相關研究證實，血小板P2Y12受體的基因多態性會影響冠心病患者的發病率。目前，由ADP誘導的血小板聚集率檢測作為評價氯吡格雷療效的一項重要指標。本課題基于前期的研究結果[11-12]，通過對298例腦卒中患者檢測其CYP2C19、P2Y12基因分型，分析患者一般資料和高危因素(高血壓、糖尿病、高血脂等)，從中篩選出CYP2C19*2患者，觀察其P2Y12不同基因位點C34T、G52T、i-T774C在用藥前后血小板聚集率的差值比較，旨在研究CYP2C19、P2Y12基因多態性與氯吡格雷抵抗之間是否存在相關性，結合血小板聚集率檢測，為個體化用藥提供參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究選取2019 年1 月至2020年12 月于貴州航天醫院住院、臨床診斷為缺血性腦卒中的患者 298 例，其中男210 例，女88 例；年齡40 ～ 85 歲，平均(65.0 ± 9.8)歲。入選患者均排除對氯吡格雷和阿司匹林過敏或不耐受，符合美國國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)≥3分，并在開展研究前簽署知情同意書。

1.2藥品、試劑及設備 硫酸氯吡格雷片(商品名：波立維，杭州賽諾菲制藥有限公司，每片75 mg)，拜阿司匹林腸溶片(德國拜耳有限公司，每片100 mg)；ADP(美國Sigma公司)，血液基因組 DNA 提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，人類 CYP2C19 基因檢測試劑盒(武漢友芝友醫療科技有限公司)，C34T、G52T、i-T774C各基因型引物(上海生工生物工程有限公司合成)；7500 型 real time Quantitative-PCR儀(美國ABI 公司)，普利生 LBY-NJ4 血小板聚集率測試儀(北京普利生儀器有限公司)。

1.3實驗方法

1.3.1CYP2C19 基因型檢測 PCR 檢測法：抽取患者服藥前當天的空腹靜脈血 2 mL于乙二胺四乙酸( EDTA) 抗凝管中，4 ℃冰箱內保存； 采用血液基因組 DNA 提取試劑盒提取入選患者 DNA 樣本，取2 μLDNA溶液，分別在紫外分光光度計260、280 nm處測定DNA溶液光密度(OD)值，估算DNA的純度與濃度。所提取的DNAOD260/OD280比值均達到1.8～2.0，說明DNA濃度達到標準，-20 ℃保存并于24 h 內檢測；取 2 μL DNA 樣本加入分裝好的 CYP2C19 基因檢測 PCR 反應管中，按要求上機檢測( AB 7500) 。CYP2C19 基因型分為野生型*1/*1，突變雜合型*1/*2、*1/*3、*1/*17，突變純合型*2/*2、 *3/*3、*2/*3、*17/*17。所有患者在治療前先接受基因多態性檢測，后首劑給予氯吡格雷負荷劑量 300 mg每天1次，之后長期給予氯吡格雷 75 mg 每天1次[13]。本研究中所有分子生物學實驗均在貴州航天醫院中心實驗室使用相關科研設備完成。

1.3.2患者一般資料及高危因素相關性分析 對研究中患者的性別、年齡、血糖、血壓、低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)等指標進行檢測，根據不同代謝表型患者進行分組，研究其相關性。

1.3.3P2Y12基因多態性檢測 C34T、G52T、i-T774C各基因型參考相關文獻[14]，使用Primer3軟件設計擴增引物和延伸引物并合成。外顯子C34T引物：上游5′-GAAATGCAAGCCGTCGAGAA-3′，下游5′-AGTGTAGAGCAGTGGGAAGA-3′。P2Y12外顯子G52T引物設計：上游5′-AAGATGAGAAACCTCAACTTTTAG-3′，下游5′-AACAGGACAGTGTAGAGCAGTG-3′。內含子i-T774C引物：上游5′-TTTGGGGAATTTAAGTGCTAC-3′，下游5′-CCACAATAGGCAGCTATAATG-3′。

1.3.4血小板聚集率檢測 抽取CYP2C19*2 基因型患者發病當天及服藥7 d后血液樣本，以5 μmmol/L ADP為誘導劑，采用光度比濁法(TPA)檢測血小板聚集率。氯吡格雷反應變異性參照ANGIOLILLOD等[15]提出的定義，以血小板聚集率與基線水平差值小于或等于10%作為氯吡格雷抵抗的標準。當血小板聚集率與基線水平差值(服用氯吡格雷前血小板聚集率-服藥后血小板聚集率)<10%認為氯吡格雷無反應，10%～<30%為低反應，≥30%視為正常反應[16]。

2 結 果

2.1CYP2C19基因型和代謝表型分布情況 入選的腦卒中患者中以CYP2C19*1/*1基因型發生率最高(39.9%)，CYP2C19*3/*3及CYP2C19*1/*17基因型發生率最低(均為0.3%)。具體結果見表1。

表1 CYP2C19 基因型和代謝表型分布情況[n( %),n=298]

2.2不同代謝表型患者基本資料及高危因素分析 4種代謝表型的患者在年齡、性別及合并高血壓、糖尿病、高血脂等高危因素間均未見明顯差異，見表2。

表2 不同代謝表型患者基本資料及高危因素分析[n(%)]

2.3298例患者P2Y12受體基因型分布情況

2.3.1C34T位點組 共成功分型出281例，其中CC型166例，CT型96例，TT型19例，基因型頻率分別為59.1%、34.2%、6.8%，其中C等位基因為76.2%，T等位基因為23.8%。

2.3.2G52T位點組 共成功分型出267例，其中GG型162例，GT型88例，TT型17例，基因型頻率分別為60.7%、33.0%及6.4%，其中G等位基因為77.2%，T等位基因為22.9%。

2.3.3i-T744C位點組 共成功分型出277例，其中TT型156例，TC型109例，CC型12例，基因型頻率分別為56.3%、39.4%及4.3%，其中T等位基因為76.0%，C等位基因為24.0%。采用χ2檢驗判斷各等位基因和基因型頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，P>0.05表示病例來自群體符合遺傳平衡，表明樣本具有一定的群體代表性。

2.4155例CYP2C19*2(GA型+AA型)患者P2Y12基因多態性對氯吡格雷抵抗的影響分析

2.4.1C34T位點組 共成功分型出147例，其中CC型83例，CT型56例，TT型8例，基因型頻率分別為56.5%、38.1%、5.4%，其中C等位基因為75.5%，T等位基因為24.5%。測定服用氯吡格雷前后各基因間血小板聚集率差值比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 P2Y12受體C34T位點各基因型分布與血小板聚集率差值比較

2.4.2G52T位點組 共成功分型出145例，其中GG型91例，GT型48例，TT型6例，基因型頻率分別為62.8%、33.1%、4.1%，其中G等位基因為79.3%，T等位基因為20.7%。測定服用氯吡格雷前后各基因間血小板聚集率差值比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 P2Y12受體G52T位點各基因型分布與血小板聚集率差值比較

2.4.3i-T744C位點組 共成功分型出148例，其中TT型78例，TC型60例，CC型10例，基因型頻率分別為52.7%、40.5%、6.8%，其中T等位基因為73.0%，C等位基因為27.0%。測定服用氯吡格雷前后各基因間血小板聚集率差值比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 P2Y12受體i-T744C位點各基因型分布與血小板聚集率差值比較

3 討 論

氯吡格雷作為臨床常用的抗血小板聚集藥物，其療效受CYP2C19基因多態性影響，超過60.6%的中國患者攜帶 CYP2C19*2、*3等位基因缺失(LOF)，而只有攜帶2個CYP2C19 LOF(PM)的患者預后情況不良[17-18]。一項關于東亞人群的研究中發現，CYP2C19*2、*3等位基因攜帶者均出現血小板較高聚集性，并可能降低氯吡格雷的治療效果[19]。既往相關研究顯示，攜帶CYP2C19*2或*3等位基因患者在氯吡格雷治療中不能有效預防腦卒中的復發[20]。本研究共298例腦卒中患者，以CYP2C19*1/*1基因型發生率最高，CYP2C19*3/*3及CYP2C19*1/*17基因型發生率最低。根據代謝表型分為：UM型4例、EM型119例、IM型133例、PM型42例，故遵義市腦卒中患者基因分布情況以EM型和IM型為主。

既往研究關于 CYP2C19 基因型與年齡、性別、合并糖尿病等基礎疾病之間的相關性存有爭議[21-22]，本研究中關于CYP2C19各基因型與患者年齡、性別、合并高血壓、糖尿病、高血脂等高危因素間均未見明顯差異，推斷可能與收集樣本量較小有關。在后續的研究中，可通過擴大樣本量，納入如民族[23]等因素綜合分析。

迄今為止，關于P2Y12基因多態性與腦卒中的研究仍較缺乏， 并且P2Y12受體基因多態性對氯吡格雷的療效影響及不良反應發生率仍存在較多爭議，所以，P2Y12受體與心腦血管等疾病發生、發展的相關性成為研究熱點[24-25]。本研究中選取CYP2C19*2患者分析P2Y12基因多態性與氯吡格雷抵抗之間相關性[26]，結果證實P2Y12受體中C34T、G52T基因位點可能與氯吡格雷抗血小板作用無明顯相關性,該結果與既往研究結果相符[27]。i-T744C位點與血小板活性有相關性，可能是導致氯吡格雷抵抗的原因之一，該結果與陳昕朦等[14]研究中缺血性腦卒中患者發生氯吡格雷抵抗的結果相一致。但還需要進一步的前沿性試驗予以論證，也可作為今后研究的一個重點方向。相關研究表明，攜帶PM基因患者的血小板抑制率

綜上所述，在條件允許的情況下，臨床上對患者進行基因型的檢測顯得十分必要，以此來克服氯吡格雷在CYP2C19 LOF患者中藥效明顯降低的現象。對于腦卒中患者可以采用聯合用藥或使用其他新型抗血小板藥物(如替格瑞洛、普拉格雷、坎格瑞洛、西洛地唑等)，這對防止患者病情進一步加重、改善預后等方面具有指導意義。另一方面，可通過患者門診復診、再次入院及電話等方式開展隨訪，收集使用藥物的主要不良反應發生情況。這樣既可以及時調整更有效的用藥方案，也有利于降低心腦血管不良事件的發生率，對抗血小板治療管理及個體化用藥均具有非常重要的研究意義。