盤狀結構域受體1在七氟烷麻醉誘導老年大鼠認知功能障礙中的作用研究*

張學長，湯杰云，王鵬程

(黃淮學院直屬附屬駐馬店市中心醫院麻醉科，河南 駐馬店 463000)

術后認知功能障礙(POCD)是指手術麻醉后出現的認知、學習、記憶及精神運動等方面障礙。目前研究認為，POCD發病機制與神經炎癥、氧化應激及神經元凋亡密切相關[1-2]。因此，抑制神經炎癥已成為POCD研究的重點機制。盤狀結構域受體1(DDR1)是與炎性反應相關，且參與了腦損傷誘發的神經功能障礙[3-4]。因此，以DDR1為研究靶標可能是POCD神經炎性反應的新機制。七氟烷(Sevo)是臨床上常用的吸入性麻醉劑，已被證實能夠引起海馬神經炎性反應和神經元凋亡誘發POCD的發生[5]。為此，本研究擬通過七氟烷吸入麻醉構建POCD大鼠模型，探究DDR1在海馬神經元炎性反應中的作用，以期為POCD的機制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 SPF級雄性SD大鼠，月齡20～22個月，體重500～600 g，購自湖南斯萊克實驗動物有限責任公司[SCXK(湘)2019-0006]。

1.1.2主要試劑 七氟烷(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)，DDR1抑制劑(DDR1-IN-5，美國MedchemExpress公司，貨號：HY-133669)，白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定試劑盒(北京中杉金橋公司，貨號：TA504958、TA500065、TA500062)，蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物技術，貨號：C0105S),免疫組織化學(免疫組化)檢測試劑盒(北京中杉金橋公司，貨號：SP-9001)，DDR1單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司，貨號：#5583)，β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗大鼠、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(碧云天生物技術，貨號：AF5001、A0192、A0208)。

1.1.3主要儀器 多功能酶標儀(長春樂鏷科技有限公司，型號：LP-5117)，熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯Olympus，型號：CKX53)，高速冷凍離心機(湖南可成儀器設備有限公司，型號：H3-18KR)，凝膠成像系統(美國Bio-Rad伯樂公司，型號：Gel Doc XR+)。

1.2方法

1.2.1動物造模與分組 將實驗SD大鼠隨機分為對照組、DDR1抑制劑組、七氟烷麻醉組、DDR1 抑制處理組，每組各10只。對照組大鼠常規培養，定量吸入空氣；DDR1抑制劑組大鼠以DDR1抑制劑5 μg側腦室注射，30 min后定量吸入空氣；七氟烷麻醉組大鼠經持續性吸入3%七氟烷6 h構建認知功能障礙模型；DDR1抑制劑處理組大鼠以DDR1抑制劑5 μg側腦室注射，30 min后吸入3%七氟烷6 h。

1.2.2Morris水迷宮實驗[1]七氟烷麻醉術后1 d，行Morris水迷宮實驗，將水迷宮劃分為4個象限，并隨機選取一個象限放置隱蔽平臺，將大鼠從4個象限隨機放入水中，記錄大鼠尋找到平臺的時間，即為逃避潛伏期。大鼠經過5 d平臺尋找訓練：4個象限入水點，每天訓練1次，每次間隔20 min，第5天記錄各組大鼠逃避潛伏期時間。空間探索實驗：第6 天撤去隱蔽平臺，將大鼠從4個象限中任一象限隨機入水，記錄大鼠60 s內穿越平臺的次數及目標象限停留時間的占比。

1.2.3ELISA檢測海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平 海馬組織碾磨后經細胞裂解液裂解，于4 ℃下12 000 r/min(離心半徑=6 cm)離心10 min，取上清液，蛋白定量后采用ELISA檢測試劑盒檢測海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.2.4HE染色觀察海馬神經元形態變化 麻醉后將大鼠頸椎脫臼處死，摘取腦片(視交叉至漏斗柄)，組織固定、石蠟包埋、切片，行HE染色，并于200倍鏡下觀察海馬CA1區域形態變化。半定量評估海馬CA1區域神經元損傷。1級：海馬CA1區域分散零散損傷神經元(<20%)；2級：海馬CA1區域存在少量損傷神經元(20%～40%)；3級：海馬CA1區域有中等數量損傷神經元(>40%～60%)；4級：海馬CA1區域有大量損傷神經元(>60%～80%)；5級：海馬CA1區域神經元存在廣泛性損傷(>80%～100%)。

1.2.5免疫組化檢測海馬組織DDR1表達 海馬組織切片經內源性過氧化物酶阻斷劑阻斷、抗原修復、組織封閉后，滴加DDR1單克隆抗體(1∶500)，孵育過夜，對應二抗孵育2 h，滴加DAB顯色液，于400倍顯微鏡下觀察DDR1相對表達量。

1.2.6Western blotting檢測海馬組織DDR1蛋白表達 按照每孔30 μg上樣，經過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，DDR1蛋白經濕轉法轉膜至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，孵育DDR1單克隆抗體，4 ℃過夜，對應二抗孵育2 h。PVDF洗膜，滴加顯影液顯影，并予Gel Doc XR+系統拍照，最后進行定量檢測。

2 結 果

2.1各組大鼠認知功能障礙情況比較 與對照組比較，七氟烷麻醉組大鼠逃避潛伏期時間延長，目標象限停留時間占比降低，穿越平臺次數減少，差異均有統計學意義(t=13.89、8.21、6.46，P<0.001、<0.001、<0.001)。與七氟烷麻醉組比較，DDR1抑制劑處理組大鼠逃避潛伏期時間降低，目標象限停留時間占比升高，穿越平臺次數增加，差異均有統計學意義(t=5.77、5.61、3.67，P<0.001、<0.001、=0.002)。見表1。

表1 各組大鼠認知功能障礙情況比較

2.2各組大鼠海馬組織炎癥因子水平比較 與對照組比較，七氟烷麻醉組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高，差異均有統計學意義(t=20.67、13.73、35.15，P<0.001、<0.001、<0.001)。與七氟烷麻醉組比較，DDR1抑制劑處理組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低，差異均有統計學意義(t=10.84、7.22、16.38，P<0.001、<0.001、<0.001)。見表2。

表2 各組大鼠海馬組織炎癥因子水平比較

2.3各組大鼠海馬CA1區域神經元損傷情況比較 對照組和DDR1抑制劑組大鼠海馬CA1區域神經元排列整齊，結構完整。七氟烷麻醉組大鼠海馬CA1區域神經元排列紊亂，部分神經元細胞核固縮，嗜酸性粒細胞數目明顯增多，海馬神經元損傷評分較對照組增加，差異均有統計學意義(t=11.91，P<0.001)。與七氟烷麻醉組比較，DDR1抑制劑處理組大鼠海馬CA1區域神經元損傷減輕，評分降低，差異有統計學意義(t=4.92，P<0.001)，大部分神經元結構正常，酸性粒細胞數目明顯減少。見圖1、表3。

表3 各組大鼠海馬CA1區域神經元損傷評分比較

注：A.對照組；B.DDR1抑制劑組；C.七氟烷麻醉組；D.DDR1抑制劑處理組。圖1 各組大鼠海馬CA1區域形態學變化(HE染色，200×)

2.4各組大鼠海馬組織DDR1蛋白相對表達比較 免疫組化檢測結果顯示，與對照組比較，七氟烷麻醉組大鼠海馬組織DDR1表達明顯增加；與七氟烷麻醉組比較，DDR1抑制劑處理組大鼠海馬組織DDR1表達明顯降低。Western blotting檢測結果顯示，與對照組比較，七氟烷麻醉組大鼠海馬組織DDR1蛋白表達水平明顯增加，差異有統計學意義(t=24.86，P<0.001)。與七氟烷麻醉組相比，DDR1抑制劑處理組大鼠海馬組織DDR1蛋白表達水平明顯降低，差異有統計學意義(t=15.04，P<0.001)。見圖2、表4。

注：A.免疫組化檢測DDR1蛋白表達(HE染色，400×)；B.Western blotting檢測DDR1表達。圖2 各組大鼠海馬組織DDR1蛋白表達

表4 各組大鼠海馬組織DDR1蛋白相對表達量比較

3 討 論

七氟烷是臨床全身麻醉的首選藥物，其具有誘導迅速、蘇醒快、對呼吸及循環抑制輕等優勢[6]。眾多研究均已證實七氟烷吸入性麻醉能夠誘導海馬神經元損傷及老年認知功能障礙，但是有關其機制尚不完全清楚。

本研究首先通過老年大鼠七氟烷吸入性麻醉構建POCD模型，結果顯示：與對照組比較，七氟烷吸入麻醉組大鼠出現典型的認知功能障礙，主要表現為逃避潛伏期時間延長，目標象限停留時間占比降低和穿越平臺次數減少。海馬CA1區域神經元損傷評分增加表明模型構建成功。既往研究已證實，七氟烷能夠誘導大鼠認知功能障礙，其機制與海馬神經元炎性細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)釋放增加，從而導致海馬神經元凋亡增加相關[7-8]。本實驗研究發現，與對照組比較，七氟烷麻醉組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高，與黃運伯等[1]研究結果一致。本研究與以往文獻報道共同表明，七氟烷誘導POCD與促進海馬神經炎癥，誘發細胞凋亡相關。因此，在七氟烷誘導的認知功能障礙中對海馬神經元炎性反應的機制進行研究具有重要意義。DDR1是受體酪氨酸蛋白激酶家族成員之一，廣泛參與細胞增殖、凋亡、纖維化及炎癥等病理生理過程[9-10]。有研究發現，DDR1表達在大鼠局灶性缺血后升高，抑制DDR1能夠顯著減少大鼠腦缺血損傷發生[11]。另外，在氧剝奪損傷的神經元細胞中DDR1蛋白表達顯著增加，抑制DDR1表達能夠促進皮質神經細胞存活，改善缺氧、缺糖誘導的大鼠皮質神經細胞損傷[12-13]。上述研究表明，DDR1在多種誘因下的神經損傷中發揮重要作用。本研究發現，與對照組比較，七氟烷麻醉組大鼠海馬組織DDR1蛋白表達明顯增加，提示DDR1在海馬神經元損傷中扮演損傷因子角色。為明確DDR1在七氟烷誘導海馬神經損傷中的作用，本研究通過大鼠側腦室注射DDR1抑制劑觀察七氟烷對老年大鼠海馬神經元損傷的影響，結果顯示，與七氟烷麻醉組比較，DDR1抑制劑處理組能夠改善老年大鼠認知功能障礙，其機制與降低DDR1蛋白表達，抑制IL-1β、IL-6、TNF-α釋放，減輕海馬CA1區域神經元損傷有關。

綜上所述，七氟烷麻醉誘導的老年大鼠認知功能障礙與海馬組織DDR1蛋白表達增加，促進海馬神經元炎性反應相關。