設(shè)施根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與未病土壤真菌多樣性比較

秦立金，劉銘，李艷麗，劉凱炎，陳凡凡，祝海穎，陸鳴，龐文敏，張志潔，劉海婷

（1.赤峰學(xué)院 農(nóng)學(xué)院；2.赤峰市農(nóng)牧業(yè)綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心；3.赤峰學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

1 引言

番茄屬于茄科番茄屬，又名西紅柿、番柿、洋柿子等，在國(guó)外有“金蘋(píng)果”“愛(ài)情果”等美譽(yù)[1]。由于管理等問(wèn)題，導(dǎo)致番茄根結(jié)線蟲(chóng)病害日益嚴(yán)重。根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne spp.）是一種在全世界發(fā)生和分布的植物內(nèi)寄生線蟲(chóng)，寄主種類達(dá)到3000多種，嚴(yán)重威脅著世界農(nóng)業(yè)的安全生產(chǎn)[2]在我國(guó)，根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)生范圍廣，發(fā)病率高，防治困難，已成為嚴(yán)重阻礙我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一大病害，每年因根結(jié)線蟲(chóng)造成經(jīng)濟(jì)損失巨大[3]。根結(jié)線蟲(chóng)病是危害番茄的主要土傳病害之一，并且根結(jié)線蟲(chóng)的入侵會(huì)使植物根系形成根結(jié)，其他病害更容易侵染，嚴(yán)重影響番茄的品質(zhì)。土壤中存在各種各樣的微生物群體，它們對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)分解、養(yǎng)分循環(huán)、土壤結(jié)構(gòu)、植物生長(zhǎng)發(fā)育以及整個(gè)生態(tài)平衡都具有重要作用[4]。真菌是有機(jī)物質(zhì)分解和土壤生物量的主要組成部分,在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中起著重要的作用[5]。

有關(guān)土壤真菌多樣性的研究已見(jiàn)報(bào)到，李天來(lái)[6]發(fā)現(xiàn)番茄連作后改變了土壤真菌種群平衡，這可能是導(dǎo)致番茄產(chǎn)生連作障礙的重要原因之一。王澎[7]等人發(fā)現(xiàn)施用有機(jī)氮(Gly)肥在一定程度上可以提高真菌的多樣性，提高抗病原菌數(shù)量。以上研究在一定程度上都表明了發(fā)病與真菌多樣性有關(guān)。

本試驗(yàn)擬測(cè)定設(shè)施番茄根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與未發(fā)病土壤的真菌多樣性指標(biāo)，分析其在界、門、綱、目、科、屬水平的多樣性變化，找出發(fā)病與未發(fā)病土壤的真菌多樣性差異，為以后根結(jié)線蟲(chóng)病的有效防控提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

設(shè)施番茄發(fā)病、未發(fā)病棚室土壤采自內(nèi)蒙古赤峰市翁牛特旗楊營(yíng)子設(shè)施番茄棚室。

2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

上茬番茄拉秧時(shí)，對(duì)設(shè)施番茄發(fā)病與未發(fā)病棚室進(jìn)行土壤取樣，每個(gè)棚室采集土壤3份；采樣時(shí)間為上茬番茄拉秧時(shí)，同時(shí)，調(diào)查根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病率及病情指數(shù)；采集回的土樣及時(shí)處理，過(guò)1mm篩，標(biāo)記，-80攝氏度冰箱冷凍，待送檢；對(duì)測(cè)得的ITS真菌多樣性數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和分析。

2.3 ITS測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程

將田間采集的土壤樣品利用OMEGA的試劑盒提取土壤DNA。對(duì)提取到的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，查看基因組DNA的完整度與濃度。利用Qubit2.0DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)加入的DNA量。ITS測(cè)序使用的文庫(kù)構(gòu)建步驟遵循Illumina測(cè)序儀文庫(kù)構(gòu)建方法。從基因組DNA樣品開(kāi)始，整個(gè)ITS測(cè)序具體步驟如下：本次測(cè)序以ITS2為目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列為fITS7GTGARTCATCGAATCTTTG，ITS4TCCTCCGCTTATTGATATGC。使用DNA模板50ng，25uL的PCR體系，使用Phusion酶擴(kuò)增25～35個(gè)循環(huán)。一輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)之后，在正反向引物兩端分別加上不同的barcodes，再進(jìn)行下一輪擴(kuò)增。擴(kuò)增完成的PCR產(chǎn)物使用beads純化之后進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。PCR產(chǎn)物用AxyPrepTM Mag PCR Normalizer做歸一化處理。構(gòu)建好的文庫(kù)上樣到cBot或簇生成系統(tǒng)，利用Illumina MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行2x300bp paired-end測(cè)序。對(duì)于MiSeq測(cè)序獲得的雙端數(shù)據(jù)，首先根據(jù)barcode信息進(jìn)行樣品區(qū)分，然后根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行merge拼接成tag，接著對(duì)拼接完成的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾，隨后進(jìn)行Q20、Q30等質(zhì)控分析。對(duì)最終獲得clean數(shù)據(jù)進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析。

2.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

采用IBM SPSS26.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算和成對(duì)數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果和分析

3.1 界水平差異

設(shè)施番茄根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌界水平絕對(duì)和相對(duì)豐度差異比較見(jiàn)表1和表2，發(fā)病土壤的Fungi/真菌界與未發(fā)病老棚土壤/CK1與未發(fā)病新棚土壤/CK2未達(dá)到差異顯著（P＞0.05），未發(fā)病老棚/CK1分別比發(fā)病/Ne和未發(fā)病新棚/CK2提高了9.62%和25.00%。

表1 根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌界水平絕對(duì)豐度差異比較

表2 根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌界水平相對(duì)對(duì)豐度差異比較

3.2 門水平差異比較

設(shè)施番茄根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌門水平絕對(duì)和相對(duì)豐度差異比較見(jiàn)表3和表4，發(fā)病土壤的/NeAscomycota/子囊菌門和Unspecified_Fungi/未指明真菌與未發(fā)病老棚/CK1和未發(fā)病新棚/CK2未達(dá)到差異顯著(P＞0.05)，Ascomycota/子囊菌門和Unspecified_Fungi/未指明真菌在未發(fā)病老棚/CK1相對(duì)豐度分別可達(dá)78.24%和3.56%（見(jiàn)表4），而在未發(fā)病新棚/CK2相對(duì)豐度分別為94.94%和3.35%。發(fā)病土壤/Ne的Basidiomycota/擔(dān)子菌門與未發(fā)病老棚/CK1和未發(fā)病新棚/CK2未達(dá)到差異顯著(P＞0.05)，但未發(fā)病老棚/CK1和未發(fā)病新棚/CK2達(dá)到差異顯著(P＜0.05)，相對(duì)豐度為18.19%和2.16%，未發(fā)病老棚土壤/CK1是未發(fā)病新棚土壤/CK2的9.69倍。

表3 根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌門水平絕對(duì)含量差異比較

表4 根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌門水平相對(duì)含量差異

3.3 綱水平差異比較

設(shè)施番茄根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌綱水平絕對(duì)和相對(duì)豐度差異比較見(jiàn)表5和表6，發(fā)病土 壤/Ne的Leotiomycetes/錘 舌 菌 綱 和Agaricomycetes/傘菌綱與未發(fā)病老棚土壤/CK1和未發(fā)病新棚土壤/CK2未達(dá)到0.05差異顯著（p＞0.05），但未發(fā)病老棚土壤/CK1與未發(fā)病新棚土壤/CK2差異顯著（p＜0.05），未發(fā)病老棚土壤/CK1分別是未發(fā)病新棚土壤/CK2的5.32倍和10.04倍（見(jiàn)表5），其中，Leotiomycetes/錘舌菌綱和Agaricomycetes/傘菌綱在未發(fā)病老棚土壤/CK1相對(duì)豐度可達(dá)35.57%和18.05%，而在未發(fā)病新棚土壤/CK2的相對(duì)豐度分別為8.40%和2.06%（見(jiàn)表6）；發(fā)病土壤的Dothideomycetes/座囊菌綱與未發(fā)病老棚土壤/CK1未達(dá)到差異顯著（p＞0.05），但與未發(fā)病新棚土壤/CK2差異顯著，（p＜0.05），是未發(fā)病新棚土壤/CK2的17.84倍（見(jiàn)表5），其中，在發(fā)病土壤/Ne和未發(fā)病新棚土壤/CK2的相對(duì)豐度分別為3.62%和3.35%（見(jiàn)表6）；發(fā)病土壤的Lecanoromycetes/茶漬綱、Sord ariomycetes/子囊菌綱和Unspecified_Fungi（未指明）與未發(fā)病土壤未達(dá)到差異顯著（p＞0.05）（見(jiàn)表5），其中，Unspecified_Fungi/未指明絕對(duì)和相對(duì)豐度占據(jù)較大比例，在3種土壤中，相對(duì)豐度分別可達(dá)74.09%、44.22%和89.41%。

表5 根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌綱水平絕對(duì)豐度差異比較

表6 根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌綱水平相對(duì)豐度差異比較

3.4 目水平差異比較

設(shè)施番茄根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌目水平絕對(duì)和相對(duì)豐度差異見(jiàn)表7和表8，發(fā)病土壤/Ne的Agaricales/傘 菌 目、Cantharellales/雞 油 菌 目、Helotiales/柔 膜 菌 目、Rhytismatales/斑 痣 盤(pán) 菌 目、Hypocreales/肉 座 菌 目、Ostropales/厚 頂 盤(pán) 目、Hymenochaetales/銹革孔菌目、Sebacinales/蠟殼耳目和Unspecified_Fungi/未指明真菌與未發(fā)病老棚土壤/CK1與未發(fā)病新棚/CK2均未達(dá)到差異顯著(P＞0.05)。發(fā)病土壤Pleosporales/腔菌目與未發(fā)病老棚土壤/CK1未達(dá)到差異顯著(P＞0.05)，但與未發(fā)病新棚土壤/CK2達(dá)到差異顯著（P＜0.05），是未發(fā)病新棚土壤/CK2的17.84倍，相對(duì)豐度分別為1.84%和0.12%。

表7 根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌目水平絕對(duì)豐度差異比較

表8 根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌目水平相對(duì)豐度差異比較

3.5 科水平差異比較

設(shè)施番茄根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌科水平絕對(duì)和相對(duì)豐度差異比較見(jiàn)表9和表10，發(fā)病土壤/Ne的Marasmiaceae/小皮傘科、Ceratobasidiaceae/角 擔(dān) 菌 科、Agaricaceae/傘 菌 科、Rhytismataceae/斑 痣 盤(pán) 菌 科、Hypocreaceae/肉 座 菌 科、Stictidaceae/肉 星 裂 菌 科、Helotiaceae/柔 膜 菌 科、Hymenochaetaceae/刺革菌科、Sebacinaceae/蠟殼耳科、Pleosporaceae/孢 菌 科、Amanitaceae/鵝 膏 科 和Unspecified_Fungi/未分類真菌與未發(fā)病老棚土壤/CK1與未發(fā)病新棚土壤/CK2均未達(dá)到0.05差異顯著(P＞0.05)。發(fā)病土壤/Ne的Psathyrellaceae/水蕨科與未發(fā)病新棚土壤/CK2達(dá)到差異顯著（P＜0.05），是未發(fā)病新棚土壤/CK2的9.13倍，相對(duì)豐度分別為1.12%和0.02%。發(fā)病土壤/Ne的Inocybaceae/絲蓋傘科與未發(fā)病老棚土壤/CK1與未發(fā)病新棚土壤/CK2均未達(dá)到0.05差異顯著(P＞0.05)，但未發(fā)病老棚土壤/CK1與未發(fā)病新棚/CK2差異顯著（P＜0.05），未發(fā)病老棚土壤/CK1是未發(fā)病新棚/CK2的4.81倍，在未發(fā)病老棚/CK1與未發(fā)病新棚/CK2的相對(duì)豐度分別可達(dá)0.04%和0.01%。

表9 根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌科水平絕對(duì)豐度差異比較

表10 根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌科水平相對(duì)豐度差異比較

3.6 屬水平差異比較

設(shè)施番茄根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌屬水平絕對(duì)和相對(duì)豐度差異見(jiàn)表11和表12，發(fā)病土壤/Ne的Agaricus/傘 草 屬、Lophodermium/散 斑 殼屬、Trichoderma/木 霉 屬、Hymenochaete/刺 革 菌 屬、Sebacina/蠟殼菌屬和Unspecified_Fungi/未分類真菌與未發(fā)病老棚土壤/CK1和未發(fā)病新棚土壤/CK2均未達(dá)到0.05差異顯著(P＞0.05)。未發(fā)病土壤/Ne的Coprinellus/鬼傘屬與未發(fā)病老棚土壤/CK1未達(dá)到0.05差異顯著(P＞0.05)，與未發(fā)病新棚土壤/CK2達(dá)到顯著差異(P＜0.05)，是未發(fā)病新棚土壤/CK2的9.13倍，相對(duì)豐度分別為0.12%和0.02%。發(fā)病土壤/Ne的Inocybe/絲蓋傘屬與未發(fā)病老棚土壤/CK1與未發(fā)病新棚土壤/CK2均未達(dá)到0.05差異顯著(P＞0.05)，但未發(fā)病老棚土壤/CK1與未發(fā)病新棚/CK2差異顯著（P＜0.05），未發(fā)病老棚土壤/CK1是未發(fā)病新棚/CK2的4.81倍，在未發(fā)病老棚/CK1與未發(fā)病新棚/CK2的相對(duì)豐度分別可達(dá)0.03%和0.01%。

表11 根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌屬水平絕對(duì)豐度差異比較

表12 根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與未發(fā)病土壤真菌屬水平相對(duì)豐度差異比較

4 討論與結(jié)論

根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyne spp.)是一種高度專化型的植物病原線蟲(chóng)，主要危害植物的根部，造成植株產(chǎn)量降低，甚至死亡。南方根結(jié)線蟲(chóng)(M.incognita)寄主范圍廣，在國(guó)內(nèi)分布最廣，危害最大，可加重土傳性真菌危害和大部分細(xì)菌病害的發(fā)生，嚴(yán)重威脅全世界西甜瓜、蔬菜、糧食作物等作物的生長(zhǎng)[10-14]，使我國(guó)各種作物年平均產(chǎn)量損失達(dá)10-15%[15]。

張仁軍[8]等人分析了煙田根際根結(jié)線蟲(chóng)病土與周邊健康土壤微生物群落，通過(guò)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)健康煙田與根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病煙田根際土壤真菌微生物群落在門和屬水平上組成相似，但物種豐度存在差異，其中，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)在健康煙田中占優(yōu)勢(shì)，子囊菌門(Ascomycoda)。在發(fā)病煙田中占優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ascomycota/子囊菌門在根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與健康土壤中差異不顯著，本研究結(jié)果與前人[8]研究結(jié)果存在不一樣的地方，分析原因可能是因?yàn)槿⊥恋攸c(diǎn)和發(fā)病作物不同導(dǎo)致的，本實(shí)驗(yàn)取土的地點(diǎn)為內(nèi)蒙古赤峰市設(shè)施番茄棚室土樣，而張仁軍等人取土土樣為云南省煙草根際土壤。

本研究結(jié)果表明，發(fā)病土壤的Basidiomycota/擔(dān)子菌門與未發(fā)病老棚和未發(fā)病新棚未達(dá)到差異顯著，但未發(fā)病老棚和未發(fā)病新棚達(dá)到差異顯著，且未發(fā)病老棚是未發(fā)病新棚的9.69倍，Basidiomycota/擔(dān)子菌門為未發(fā)病土壤的優(yōu)勢(shì)菌群，此結(jié)果與前人[8]一致。陳波[9]等人對(duì)香蕉枯萎病區(qū)土壤真菌多樣性進(jìn)行了分析，發(fā)病同一地區(qū)蕉園中的發(fā)病蕉園土壤真菌群落多樣性比健康土壤豐富，但未進(jìn)行界、門、綱、目、科、屬水平的具體分析。

本研究結(jié)果表明，設(shè)施番茄根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病與未發(fā)病土壤，未發(fā)病老棚和新棚土壤的真菌群落多樣性不同，未發(fā)病老棚Ascomycota/子囊菌門、Leo-tiomycetes/錘舌菌綱、Agaricomycetes/傘菌綱、Inocybaceae/絲蓋傘科、Inocybe/絲蓋傘屬顯著高于未發(fā)病新棚，發(fā)病土壤與未發(fā)病老棚的Pleosporales/腔菌目顯著高于未發(fā)病新棚，發(fā)病土壤Psathyrellaceae/水蕨科、Coprinellus/鬼傘屬顯著高于未發(fā)病新棚。綜上所述，內(nèi)蒙古赤峰地區(qū)設(shè)施番茄根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病土壤和未發(fā)病老棚土壤的真菌多樣性高于未發(fā)病新棚土壤。