麻地膜覆蓋對番茄根際土壤微生物群落結構的影響

鄒麗娜， 柳婷婷， 李文略， 駱霞虹， 朱關林， 安霞

(浙江省農業科學院 浙江省蕭山棉麻研究所 浙江省園林植物與花卉研究所，浙江 杭州 311251)

地膜覆蓋具有提高土壤肥力、改善土壤結構、調節土壤溫濕度、提高作物產量和改善土壤微生物群落多樣性等作用[1-2]，其優異的物理機械性能和低廉的價格使地膜成為最不可或缺、消費最多的農業生產物資[3]。自20世紀50年代以來，塑料地膜覆蓋已被世界各地廣泛使用，特別是在中國，目前約有15%～19%的耕地使用塑料薄膜覆蓋[4-5]。然而由于塑料地膜的廣泛使用，有大量無法回收的塑料薄膜殘留物留在土壤中，土壤中塑料薄膜的殘留量約為50～250 kg·hm-2，造成了嚴重的環境污染[6-8]。因此，尋求綠色環保的地膜具有重要意義。

可降解地膜是以天然植物纖維及淀粉等材料為原材料，經過改性等工藝措施加工制備而成，其推廣使用緩解了農田生態環境污染，并可提高農作物產量，推進綠色農業發展。麻地膜以天然麻類纖維為主要成分，其原料來源廣泛且性能優良，是一種新型綠色環保的覆蓋措施，具有成本低、可降解等優勢，可提高土壤養分，增加作物產量，廣泛應用于作物種植[9-10]。

土壤微生物群落在養分循環、維持土壤結構等方面起著至關重要的作用，其多樣性是土壤質量的敏感指標，能反映土壤的細微變化，為評價土壤功能提供信息[11]。不同田間管理措施可能通過影響微生物群落的組成，最終影響作物品質[12]。因此，研究不同田間管理措施對土壤微生物群落結構的影響已成為可持續農業的重要環節[13]。已有研究主要集中在地膜覆蓋對土壤水分、土壤結構、土壤營養和作物產量的影響，而忽略了其對土壤微生態環境和土壤微生物群落演化的影響[14]。土壤中的真菌和細菌表現出不同的群落動態。因此，了解覆膜措施下土壤生態系統的變化過程，同時研究真菌和細菌群落是非常必要的[15]，但麻地膜覆蓋對土壤細菌和真菌微生態變化的響應尚未有報道。

本文通過大棚番茄種植試驗，研究不同覆膜措施處理下，農田土壤化學性質、酶活性以及細菌和真菌微生物群落結構的變化，考察土壤細菌和真菌群落結構變化與土壤環境因子的相關關系，以期為麻地膜在農業生產的廣泛使用提供理論依據和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料與實驗設計

本試驗在浙江省杭州市蕭山區農業科學技術研究所大棚內進行，種植的番茄品種為春季大果型番茄杭雜603，田塊土壤初始理化性質為pH 4.89，有機質4.02%，速效鉀208 mg·kg-1，有效磷112 mg·kg-1，速效氮256 mg·kg-1。設置3種覆蓋處理：不覆蓋、麻地膜覆蓋、塑料地膜覆蓋，分別記作TCK、TB、TP。每個處理設置3個重復，分別種植16株番茄，采用隨機區組排列。番茄于2018年3月21日移栽，6月20日收獲。采用五點取樣法在每個處理田塊進行取樣，每隔4株間取樣，將采集的5個點的土樣混合均勻后為該田塊的土樣。取樣時將番茄植株挖出后，抖落根系上較大的土塊，黏在根系上的為根際土壤。將充分混合后的土樣分成2份，一份用于土壤理化性質測定，另一份于-80 ℃冰箱保存用于微生物測定。

1.2 測試方法

土壤酸堿度采用pH電極法測定，土水比為2.5∶1 (m/V)。土壤有機質采用重鉻酸鉀法測定。土壤水解氮采用堿解擴散法測定。土壤速效鉀采用醋酸銨提取、火焰光度計測定。土壤有效磷采用鹽酸-氟化銨溶液浸提、鉬銻抗比色法測定。

土壤酶活。將土壤鮮樣采用酶活檢測試劑盒，根據微量比色法，分別測定土壤中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、乳酸脫氫酶(LDH)、NAD-蘋果酸脫氫酶(NAD-MDH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、乙醇脫氫酶(ADH)和脫氫酶(DHA)的含量。

土壤DNA提取和PCR擴增。土壤樣品委托浙江天科高新技術發展有限公司進行高通量測序分析。采用FASTDNA SPIN DNA試劑盒(MP Biomedicals)提取土壤樣品DNA，提取后用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，并采用微量分光光度計檢測DNA濃度和純度。16S rRNA擴增所用的引物為V3-V4通用引物338F/806R (338F: ACTCCTACGGGAGGCAGCA; 806F: GGACTACHVG GGTWTCTAAT)[16]。18S rRNA擴增所用的通用引物為ITS1/ITS2 (ITS1: CTTGGTCATTTAGAGGA AGTAA; ITS2: GCTGCGTT CTTCATCGATGC)[17]。通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫大小; 為了得到均勻的長簇效果和高質量的測序數據，使用Qubit3.0 熒光定量儀進行文庫濃度測定。最后通過測序(Miseq, Illumina, USA)得到數據進行生物信息學分析。對測序得到的原始數據進行拼接、過濾得到有效數據。利用Uparse軟件(Uparse V8.1.1861)對所有樣品的全部有效數據進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units)。利用uclust方法與Silva數據庫(http://www.arb-silva.de)進行物種注釋分析。

1.3 數據分析

利用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，不同處理下不同數值之間的顯著性差異分析利用最小顯著差法(LSD)進行測定，P<0.05被認為具有顯著差異，表中不同字母表示處理組之間具有顯著差異。利用Canoco 5軟件進行微生物群落結構與環境因子的冗余分析。圖表中的數據均為3個重復的平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 不同覆蓋措施對土壤化學性質的影響

在不同覆蓋措施下，土壤化學性質有一定的差異變化。表1顯示，麻地膜覆蓋與不覆蓋處理相比，土壤pH值顯著提高，有機質含量顯著降低，水解氮、有效磷和速效鉀含量均沒有顯著變化。表明麻地膜對土壤養分的影響較小。但是，塑料地膜覆蓋與不覆蓋相比，有機質、水解氮和速效鉀含量顯著降低，表明塑料地膜覆蓋后，土壤養分有效性降低。

表1 不同覆膜處理土壤化學性質的變化

2.2 不同覆蓋措施對土壤酶活性的影響

從不同覆蓋措施酶活差異來看(表2)，麻地膜覆蓋顯著提高了超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、NAD-蘋果酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶和乙醇脫氫酶6種酶的活性，分別提高了9.1%、68.1%、38.4%、35.4%、70.2%和134.8%。而塑料地膜僅顯著提高4種酶的活性，包括過氧化物酶、乳酸脫氫酶、NAD-蘋果酸脫氫酶和乙醇脫氫酶，分別提高了64.5%、14.8%、13.9%和147.9%。表明不同覆膜處理對土壤酶活性的影響不同，其中，麻地膜可以顯著提高大多數酶的活性。

表2 不同覆膜處理土壤酶活的變化

2.3 不同覆蓋措施對土壤微生物多樣性的影響

微生物多樣性分析可以反映微生物分布豐度和群落多樣性，其中Ace指數和Chao1指數為物種豐富度指數，Shannon指數和Simpson指數為物種多樣性指數。不同覆蓋措施處理下，9個土壤樣品共得到的細菌序列數為477 474，平均序列長度為418 bp。根據α多樣性指數可以發現，麻地膜和塑料地膜處理對土壤細菌多樣性均無顯著影響(表3)。對不同覆蓋處理的土壤真菌進行高通量測序分析，9個土壤樣品共得到457 057條有效序列，平均長度為234 bp。結合真菌的α多樣性指數，可以發現，與不覆膜相比，麻地膜和塑料地膜對真菌群落分布的豐度均沒有顯著影響，但是顯著增加了真菌群落多樣性。

表3 不同處理下土壤細菌微生物多樣性

2.4 不同覆蓋措施對土壤微生物群落結構的影響

不同覆蓋處理下農田土壤細菌和真菌在門和屬水平上相對豐度>1%的物種如圖1所示。從細菌門水平上進行分析可以發現(圖1中A)，不同覆蓋措施下門水平細菌群落組成變化較小。與不覆膜相比，麻地膜顯著增加了Firmicutes的相對豐度，從0.8%增至1.2%，顯著降低了Acidobacteria的相對豐度，從2.5%降至1.9%。而塑料地膜顯著增加了Gemmatimonadetes的相對豐度，從0.6%增至2.2%，顯著降低了Verrucomicrobia的相對豐度，從2.8%降至1.0%。在真菌門水平可以發現(圖1中B)，在所有土壤中，Ascomycota的相對豐度最高，達到64.9%～86.9%，其次為Basidiomycota(3.5%～22.8%)和Mortierellomycota(7.3%～10.6%)。不同覆膜處理對土壤真菌門水平的影響較小，真菌微生物組成并無顯著變化。

進一步從細菌屬水平上進行分析可以發現(圖1中C)，在不同處理下土壤中的優勢菌屬為Rhodanobacter(4.7%～7.7%)、Pedobacter(3.2%～5.5%)、Devosia(3.3%～4.5%)、Panax_ginseng(1.9%～4.0%)、Chitinophaga(1.8%～3.8%)、Arthrobacter(1.5%～3.3%)、Taibaiella(1.4%～3.2%)和Sphingobium(1.5%～3.1%)。與不覆膜相比，麻地膜顯著改變了4種菌屬的相對豐度，顯著增加了土壤中Arthrobacter、Glycomyces和Sphingobium的相對豐度，分別從2.0%、0.9%、1.5%增至3.3%、1.9%、3.1%；顯著降低了Rhizomicrobium的相對豐度，從1.5%降至1.0%。與不覆膜相比，塑料地膜顯著改變了7種菌屬的相對豐度，顯著增加了Filimonas和Hirschia的相對豐度，分別從0.6%、0.5%增至1.3%、1.2%；顯著降低了其他菌屬的相對豐度，包括Arthrobacter、Terrimonas、Asticcacaulis、Burkholderia和Opitutus，如Arthrobacter的相對豐度從2.1%降低至1.5%；Opitutus的相對豐度從2.3%降低至0.4%。從真菌屬水平進行分析(圖1中D)，可以發現，相對豐度>1%的菌屬主要來自Ascomycota和Basidiomycota菌門。不覆膜處理下，土壤中的真菌主要以Fusarium(36.9%)、Penicillium(14.6%)和Trichoderma(10.2%)為主。麻地膜處理后土壤真菌主要以Fusarium(14.3%)、Cladosporium(12.8%)和Mortierella(10.0%)為主。麻地膜處理顯著減少了Fusarium的相對豐度，從36.9%降低至14.3%；而顯著增加了Acremonium和Alternaria的相對豐度，分別從0.7%、0.8%增至4.7%、1.7%。塑料地膜處理顯著降低了Fusarium和Penicillium的相對豐度，分別從36.9%、14.6%降至19.9%、2.2%；顯著增加了Crustoderma和Cryptomarasmius的相對豐度，分別從1.7%、0.4%增至3.8%、3.4%。

A—16S rRNA門水平；B—ITS rRNA門水平；C—16S rRNA屬水平；D—ITS rRNA屬水平。

2.5 不同覆蓋措施下土壤微生物群落與環境因子的相關關系

將相對豐度>1%的細菌菌屬和真菌菌屬與不同環境因子進行冗余分析(圖2)可以發現，土壤速效鉀、水解氮、有機質及部分酶活性(包括超氧化物歧化酶、過氧化物酶、乙醇脫氫酶和乳酸脫氫酶)是影響不同處理下細菌群落組成的主要因素，其中，速效鉀對細菌群落的影響具有顯著性，對群落組成變化的解釋比例達30.1%，其次是乳酸脫氫酶(25.5%)和超氧化物歧化酶(20.3%)。第一排序軸和第二排序軸分別解釋了總差異的40.8%和17.5%(圖2中A)。在不覆膜處理下，土壤細菌群落組成與速效鉀、水解氮和有機質正相關，而與其他環境因子負相關。在地膜覆蓋處理下，土壤細菌群落組成主要與部分酶活正相關。在麻地膜覆蓋下，土壤細菌群落組成與超氧化物歧化酶、過氧化物酶、乙醇脫氫酶活性正相關；而在塑料地膜覆蓋下，土壤細菌群落組成與過氧化物酶、乙醇脫氫酶和乳酸脫氫酶顯著正相關。土壤速效鉀、水解氮、有效磷、有機質、pH值、過氧化物酶和乙醇脫氫酶是影響不同處理下真菌群落組成的主要因素。速效鉀、有機質、有效磷、乙醇脫氫酶和過氧化物酶對真菌群落的影響具有顯著性，其中速效鉀對真菌群落組成變化的解釋比例為29.1%，是主要的影響因素。第一排序軸和第二排序軸分別解釋了總差異的30.9%和25.7%(圖2中B)。同樣可以發現，不覆膜處理下，土壤真菌群落組成與土壤速效鉀、水解氮、有效磷和有機質正相關，而覆膜處理下，土壤真菌群落組成與土壤pH值、乙醇脫氫酶和過氧化物酶正相關。

A—細菌；B—真菌；AK—速效鉀；AN—水解氮；AP—有效磷；OM—有機質；SOD—超氧化物歧化酶；POD—過氧化物酶；ADH—乙醇脫氫酶；LDH—乳酸脫氫酶

3 討論

不同覆蓋方式能夠顯著影響土壤水熱狀況，進而影響土壤養分和微生物多樣性。研究表明，塑料地膜的長期覆蓋可加速土壤有機質的分解[14]。本研究中，不同覆膜處理條件下土壤有機質均顯著減少，這與前人的研究結果是一致的。也有研究表明，覆膜處理可以增強有機物的礦化速率，礦化量的增加可能會導致土壤全效養分的降低[18]，這可能是塑料地膜覆蓋下土壤養分含量降低的原因。土壤細菌參與了多種有機物和無機物轉化，是土壤微生物的主要組成，在維持土壤生態平衡過程中起重要作用[19]。麻地膜和塑料地膜處理對細菌的群落分布豐度均沒有顯著影響，表明覆膜處理使微生態系統對環境變化具有更強的適應性[13]。真菌是土壤有機質分解和生物量的主要組成，在農業生態系統中具有較為重要的作用[20]。有研究表明，地膜全覆蓋種植可以通過增加土壤貯水量，改善土壤理化性狀，從而提高真菌多樣性[21]，這與本研究結果是一致的。微生物是土壤生態系統中最具活力的部分，它們對土壤微生態環境和物理化學性質的變化較為敏感[22]。農藝措施可以改變土壤環境因子，而土壤環境因子的變化可以進一步影響土壤微生物群落結構[23]。有研究發現，土壤pH值是影響植物種植過程中土壤致病和有益微生物的最重要的因素之一[24]。然而，在本研究中，速效鉀是影響細菌和真菌群落組成的最主要的因素。在本研究中，細菌和真菌都受到幾種環境因子的共同影響，表明這些微生物豐度變化取決于土壤化學性質和酶活的組合影響，這意味著它們受到土壤整體的影響[25]。部分酶活性與土壤理化性質直接存在顯著的相關關系，表明土壤酶活與速效養分直接存在協同作用，共同參與農田土壤養分循環[26]。

番茄種植以后，根系分泌物的產生可以作為重要的黏合劑，增加土壤團聚體[27]。而土壤團聚體的穩定性受到Actinobacteria的活性影響[28]。此外，研究表明，Actinobacteria參與了有機質的分解并在土壤代謝功能中扮演著重要的角色[29]。這可能是番茄種植后土壤Actinobacteria成為優勢菌門的原因。Firmicutes包括許多潛在的生物防治劑，并且許多研究報道發現在抑制性土壤中Firmicutes具有較高的豐度，Firmicutes可能在不同的土壤傳播疾病系統中發揮抑制疾病的作用[30-31]。因此，麻地膜覆蓋增加了Firmicutes的相對豐度，可能增加了土壤的抑病能力。本研究發現，麻地膜覆蓋增加了多種土壤碳降解相關的細菌，可能促進了土壤碳循環過程。其中，Arthrobacter在土壤中廣泛存在，并且能夠分解多種芳香化合物[2]。Glycomyces是耐鹽和耐熱菌屬，可以促進土壤中有機物質、木質素和抗生素的降解[32-34]。Sphingobium是典型的纖維素降解菌，纖維素降解細菌數量的增加，有助于纖維素降解與養分釋放[35]同時具有降解復雜有機物的能力[36]。Rhizomicrobium是典型的固氮細菌[37]。塑料地膜與麻地膜相比，更能影響土壤細菌組成。有研究發現，Terrimonas與病原菌呈顯著負相關關系，揭示這些微生物可能是參與疾病抑制的關鍵類群[38]。Asticcacaulis對植物生長可能具有促進作用[39]。此外，有研究表明，Asticcacaulis對木質纖維素具有較強的吸附能力，表明它在纖維素和半纖維素的分解中發揮重要作用[40]。Burkholderia是一種革蘭氏陰性菌，在高產的農田土壤中廣泛存在，表明它們的存在可能促進植物高產，提高土壤生物健康[41-42]，也可以抑制番茄等植物的枯萎病[43]，抑制致病細菌的入侵[44]。目前，對Opitutus在土壤生態系統中的生態功能知之甚少[45]。有研究發現，Opitutus與土壤微生物活性、微生物量碳和氮顯著正相關[46]；也有研究發現，Opitutus是最成功的新鮮植物源碳的覓食者之一，表明Opitutus可以影響根際土壤碳循環[47]。塑料地膜的覆蓋顯著降低的細菌菌屬，可能與土壤健康、疾病抑制和碳循環有關，表明塑料地膜覆蓋可能一定程度降低了土壤養分，增加了土壤中病原菌繁殖，增加了植株發病風險。

在研究中，Ascomycota和Basidiomycota是土壤中數量最多的真菌門，占樣品總序列的60%以上，這與前人研究一致[48-49]。Ascomycota和Basidiomycota菌門的比例是影響土壤抗性的重要因素[50]。Ascomycota是一種土壤中常見的腐生菌，可分解難降解的有機物，在土壤養分循環中起著重要作用[51]。Basidiomycota中有許多耐藥微生物，可提高土壤的抗病性[52]。本研究中，麻地膜顯著減少了Fusarium的相對豐度，顯著增加了Acremonium的相對豐度；塑料地膜也顯著減少了Fusarium的相對豐度。Fusarium在分解纖維素和降解有機質方面起到了一定的作用，同時也是典型的植物病原菌之一，可引起番茄枯萎病[53]。Acremonium是一種抑菌微生物，可分泌一些酶或者其他物質來抑制細菌和真菌的生長繁殖[54]，表明覆膜處理可有效抑制Fusarium的繁殖，對緩解番茄枯萎病具有一定的影響；而麻地膜處理顯著增加了抑菌真菌的相對豐度，抑制了土壤中病原菌的繁殖，降低了植物的發病風險。

4 小結

本研究通過對比麻地膜和塑料地膜覆蓋的土壤理化性質、酶活性和微生物群落結構的變化，明確了麻地膜施用的優點，理清了麻地膜影響土壤微生物群落組成和結構的主要影響因素，為麻地膜后續的應用提供了理論基礎。研究發現，麻地膜覆蓋下，土壤pH值顯著增加，有機質顯著降低，但并沒有顯著影響土壤有效態氮磷鉀含量，而塑料地膜覆蓋一定程度降低了土壤養分。不同覆膜處理對土壤酶活性影響不同，麻地膜覆蓋顯著增加了土壤酶活性。不同覆蓋措施沒有顯著影響農田土壤細菌多樣性，麻地膜處理增加了土壤碳降解相關的細菌，促進了土壤碳循環過程。不同覆蓋措施顯著增加土壤真菌多樣性，可以有效抑制Fusarium的繁殖，對緩解番茄枯萎病具有一定的影響；麻地膜處理顯著增加了抑菌真菌的相對豐度，抑制了土壤中病原菌的繁殖，降低了植物的發病風險。速效鉀、乳酸脫氫酶和超氧化物歧化酶是影響土壤細菌群落結構的主要因素，而速效鉀、有機質、有效磷、乙醇脫氫酶和過氧化物酶是影響真菌群落的主要影響因素。綜合試驗結果發現，麻地膜覆蓋有利于提高酶活性，且促進了土壤有益細菌和真菌的生長，提高了土壤環境健康。