米諾環素改性純鈦抗菌性能及其對人骨髓間充質干細胞成骨分化的影響

竇林波，王子佳，閆茹茜，喬雪，張彥聰

1 德州市人民醫院口腔科，山東德州 253000；2 德州市婦女兒童醫院口腔科；3 濰坊醫學院口腔醫學院

純鈦（Ti）因其良好的生物相容性和耐腐蝕性而被廣泛應用于外科植入、骨科固定和牙種植體材料［1-3］。隨著種植時間延長，種植體被細胞、細胞因子和骨髓腔等包圍，骨髓腔內的部分骨髓間充質干細胞逐漸分化為成骨細胞，誘導種植體表面成骨，形成新的骨組織，促進骨愈合［4-7］。然而，鈦植入物及周圍組織感染仍然是一個難題，由于種植體表面生物膜的形成常導致植入失敗［8-10］。因此，鈦植入物的抗菌表面改性對于防止細菌的初始黏附和促進骨結合性能具有重要意義［11-14］。米諾環素是第二代半合成四環素廣譜抗生素，其抗菌譜與四環素相似，具有較高的親脂性，組織穿透性強，抑菌效果好。米諾環素特異性地與核糖體的305 亞基結合，并阻止氨基酞tRNA 進入該位點。因此，它阻止了肽鏈的延伸，抑制病原體的蛋白質合成，并發揮抗菌作用。該藥物在低濃度具有抑菌作用，高濃度具有殺菌作用。其抗菌譜包括革蘭陽性菌和革蘭陰性菌［15-18］。米諾環素可用于慢性牙周炎的治療，其強大的抗炎特性使其有望用于種植體周圍炎的預防［19］。但目前還不能確定米諾環素是否可以作為金屬涂層。口腔種植體表面結構及成分對細菌附著的影響及不同種植體對骨結合的影響，目前尚無系統研究［20］。我們開發了一種米諾環素涂層純鈦作為抗菌材料和骨再生誘導材料，使用聚多巴胺（PD）作為米諾環素涂層的涂層介質［21］。2020 年6 月—2022 年2 月，本研究制備并評價米諾環素包被的純鈦的抗菌性能，并探討其對人骨髓間充質干細胞（hMSC）成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 Ti片（純度＞99.9%）購自西北有色金屬研究院。Tris-HCl 緩沖液購自美國謝爾頓科學公司，Dulbecco 改良Eagle 培養基含有低糖、磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）、胰蛋白酶-乙二胺四乙胺四乙酸溶液、青霉素-鏈霉素溶液購自美國GibcoBio-Rad實驗室，胎牛血清（FBS）購自加拿大Wisent 公司，腦心浸液培養基購自美國BD 公司。光譜儀購自日本Rigaku 公司，掃描電鏡購自荷蘭FEI 公司，X 射線光電子能譜（XPS）購自日本Rigaku 公司，激光共聚焦顯微鏡LSM510 購自德國Zeiss 公司，LIVE/DEADBacLaght 細菌活性試劑盒購自美國Invitrogen 公司，厭氧產氣袋購自法國梅里埃公司，37 ℃空氣孵箱購自上海一恒精密儀器有限公司。

1.2 米諾環素涂層Ti 片（MHCI-Ti）制備 將Ti 片磨碎并拋光至鏡面表面，用丙酮、乙醇和蒸餾水超聲清洗15 min。將Ti片浸入鹽酸多巴胺溶液（2 mg/mL、10 mmol/L Tris-HCl緩沖液、pH 8.5）中，在軌道振動床上以50 r/min 攪拌4 h。徹底沖洗樣品，并在蒸餾水中攪拌過夜。將PD 涂層的Ti 片分別浸入100、200、500 μg/mL米諾環素溶液中，分別為100 μg/mL組、200 μg/mL組、500 μg/mL組，在37 °C下孵育過夜。

1.3 米諾環素的定量檢測 將涂層后從樣品中提取的上清液75 mL 置于96 孔板中，與100 mg/mL 熒光素溶液25 mL 在室溫下反應1 min。使用光譜儀測量樣品的熒光強度（480 nm 激發波長、520 nm 發射波長）。將每個樣品中米諾環素的實際濃度與已知濃度的米諾環素標準品（500 μg/mL）的熒光強度進行比較。通過排除上清液中未反應的米諾環素，計算固定化的米諾環素的量。

1.4 化學成分分析 將MHCI-Ti 在70%乙醇中浸泡15 min 并用紫外線照射，用PBS 沖洗3 次。通過掃描電鏡獲取Ti 片的表面形貌。采用XPS 分析表面化學成分，用峰值擬合軟件分析每個樣品的化學成分。

1.5 細菌黏附檢測 取樣品在24孔板中加入2 mL無菌人工唾液（0.33 g/L 磷酸一鉀、0.34 g/L 磷酸二氫鈉、1.27 g/L 氯化鉀、0.16 g/L 氯化銨、0.58 g/L氯化鈉、0.17 g/L 二水合氯化鈣、0.6 g/L 硫氰酸鈉、0.2 g/L尿素、0.03 g/L葡萄糖、0.002 g/L維生素C、2.7 g/L 黏蛋白，在37 ℃下培養4 h。將拋光的Ti 和MHCI-Ti 培養在含變形鏈球菌（30 μL）的2 mL 腦心浸液培養基中，由厭氧產氣袋來提供厭氧環境，置于37 ℃空氣孵箱。每2天用等量的新鮮無菌培養基替換該培養基。7 d 后從培養基中取出單獨的樣品進行生物膜評價。樣品在2.5%戊二醛0.1 mol/L PBS中固定2 h。然后，將樣品用（50%、70%、80%、90%和100%）乙醇溶液進行脫水和風干。通過掃描電鏡獲得Ti薄片的放大圖像。檢查前給樣品涂上20～30 nm的金。用LIVE/DEADBacLaght 細菌活性試劑盒對黏附菌進行染色。將熒光素二乙酸溶液、溴化乙錠各2 μL 混合在1 mL 冷蒸餾水中，將200 μL 最終混合物滴入取樣斑塊上，0 ℃培養15 min。然后在LSM510上對固定的生物膜進行觀察。

1.6 hMSC 培養與成骨分化 在24 孔培養板中，將hMSC 以每孔5×104個細胞分別接種在拋光的Ti、MHCI-Ti（200 μg/mL）上。樣品用70%乙醇消毒，用無菌PBS 洗滌2 次，用短波長紫外光照射30 min。將hMSC在正常培養基中培養1天，然后于成骨培養基中（含有15% FBS、1% 抗生素/抗真菌溶液、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/mL L-抗壞血酸、1×10-7mol/L 地塞米松）培養，隔48 h 補充1 次培養基，持續28 h。

1.7 細胞活力檢測 分別于培養第1、4、7 天，采用MTT法，取1.5中培養的細胞，用PBS洗滌，并在添加40 μL（5 mg/mL）MTT的培養基中培養，用400 μL二甲基亞砜溶解4 h內形成的紫色MTT甲瓚晶體，在96孔的100 μL微孔板中測定570 nm波長處的吸光度值。

1.8 堿性磷酸酶（ALP）活性檢測 在成骨誘導后的第7、14、21、28天，取1.5中培養的細胞，與400 μL對硝基苯基磷酸鹽（Thermo）在25 ℃下孵育30 min。用95% M-PER 蛋白提取試劑盒（Thermo）和5%蛋白酶抑制劑雞尾酒（Thermo）提取培養細胞中的總蛋白，用200 μL的氫氧化鈉溶液終止反應，測定405 nm波長處的吸光度值，以測定對硝基苯酚的釋放量。

1.9 細胞鈣沉積檢測 采用茜素紅染色法。在成骨誘導后第7、14、21、28天，取1.5中培養的細胞，用冰冷的乙醇固定1 h，然后用40 nmol/L 茜素紅S 溶液（pH 4.2）處理30 min，茜素紅結合鈣用10wt%十六烷基吡啶在10 mmol/L 磷酸鈉（pH 7.0），室溫下提取20 min。在96 孔的100 μL 微孔板中測定570 nm波長處的吸光度值。

1.10 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，兩組比較采用t檢驗；多組比較采用方差分析或重復測量數據的方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MHCI-Ti 的米諾環素定量 100 μg/mL 組、200 μg/mL組、500 μg/mL組最終固定在樣品上的米諾環素量分別為1.25、1.90、1.97 μg。200 μg/mL組米諾環素量高于100 μg/mL組（P＜0.05），200 μg/mL組米諾環素量與500 μg/mL組比較差異無統計學意義（P＞0.05）

2.2 MHCI-Ti 表面的化學成分 掃描電鏡圖像顯示，Ti 和MHCI-Ti 表面形態相似，見圖1A。MHCI-Ti表面的N1s（399 eV）峰的強度高于Ti 表面；N1s 和Ti-O-N峰的出現表明PD和米諾環素被成功覆蓋，見圖1B。

圖1 MHCI-Ti的特征

2.3 兩種樣本細菌黏附情況 變形鏈球菌在樣品上培養7 d 后電鏡下觀察到大量的細菌簇，見圖2A～D，與MHCI-Ti相比，Ti表面附著的細菌相對較多。激光共聚焦顯微鏡結果顯示，Ti表面有一層明顯的細菌層綠色細菌層（圖2E）；MHCI-Ti表面有一層死亡的微生物層（圖2F-H），其中MHCI-Ti（200 μg/mL組）完全為紅色，表示其抗菌性能最高（圖2G）。

圖2 培養第7天電鏡下及共聚焦熒光顯微鏡下變形鏈球菌的情況

2.4 兩種樣本hMSC 的活力和成骨分化 Ti 與MHCI-Ti 表面的hMSC 活力、ALP 活性、鈣沉積比較 見表1～3。

表1 Ti與MHCI-Ti的hMSC活力比較（± s）

表1 Ti與MHCI-Ti的hMSC活力比較（± s）

注：與Ti比較，*P＜0.05。

3 討論

表2 Ti與MHCI-Ti的ALP活性比較（ ± s）

表2 Ti與MHCI-Ti的ALP活性比較（ ± s）

注：與Ti比較，*P＜0.05。

表3 Ti與MHCI-Ti的鈣沉積比較（± s）

表3 Ti與MHCI-Ti的鈣沉積比較（± s）

注：與Ti比較，*P＜0.05。

Ti 種植體被廣泛應用于臨床骨科材料中，牙種植體是其中之一［22］。然而，種植體的使用會導致種植體相關的感染，最終種植體松動甚至脫落。種植體周圍的穩定性取決于周圍骨組織和軟組織的穩定性，特別是骨組織的穩定性，這主要取決于骨結合的過程［23］。口腔的內部環境特別適合病原微生物的定植和繁殖，降低種植體骨結合能力和愈合速度，周圍軟組織的穩定性被破壞，形成種植體周圍炎，進一步影響種植體修復的療效。菌斑生物膜是一種細菌性生物膜，為基質包裹的互相黏附或黏附于口腔內牙面、牙間或修復體等硬質表面的軟而未礦化的細菌性群體［24-25］。細菌在菌斑生物膜內進行復雜的生長代謝活動，并且憑借生物膜這種獨特結構能夠牢固附著，難以被清除；菌斑生物膜能抵抗宿主防御或抗生素等殺滅作用；還能使其中的各種細菌在合適的微環境下發揮不同的致病作用。以口腔種植體為代表的生物材料一經植入口腔中，菌斑即開始在其表面形成。成熟的齦上菌斑引起齦炎，并會影響齦下菌斑的形成，在可疑致病菌的參與下，會導致牙周炎或種植體周圍炎［26］。由純Ti 制作的種植體系統的基臺、體部的穿齦部分以及連接處常暴露于口腔復雜的環境中，易因物理、化學、生物及機械等因素的損傷，造成其表面粗糙度的增加，進而促進細菌的黏附和菌斑生物膜形成、生長。菌斑生物膜的存在及種植體腐蝕是導致種植體周圍炎發生的兩個重要激發因素［27-28］。因此對純Ti 進行表面改性，提高其抗菌性能，創造一種可減少細菌黏附的新型表面意義重大。為了解決種植體周圍炎的問題，我們對純鈦種植體進行了表面功能化修飾，以實現抗菌效果，增強骨結合能力。在本研究中，我們開發了MHCI-Ti作為抗菌材料和骨再生誘導材料。多巴胺能夠通過其鄰苯二酚或醌基官能團共價接枝米諾環素上所富含的親核基團（如氨基）。將Ti 片浸入鹽酸多巴胺溶液中繼而接枝米諾環素。采用XPS分析表面化學成分，發現MHCI-Ti表面的N1s（399 eV）峰的強度高于Ti 表面和Ti-O-N 峰的出現表明PD 和米諾環素素被成功包被在Ti表面。

鏈球菌屬通常是口腔內主要的定植菌群，最早定植于口腔內，且為齦上菌斑生物膜的優勢菌群。牙周菌斑內的細菌絕大多數正常菌群，不會造成宿主致病。只有在致病菌的參與下才會引發種植體周圍炎。因此本研究采用變形鏈球菌菌株來模擬致病性的菌斑生物膜，考察菌斑生物膜在的Ti 和MHCITi 表面的黏附情況。結果顯示，MHCI-Ti 具有較低的細菌黏附率。

種植體的遠期成功率與種植體材料的成骨誘導活性密切相關。ALP活性是成骨細胞基質成熟的標志，是成骨細胞分泌骨基質繼而礦化的功能活性酶。因此ALP 是目前檢測成骨細胞分化的主要特征酶之一。ALP 主要存在于胞質中，它可使無機磷酸鹽水解，從而降低焦磷酸鹽濃度，增加局部無機磷酸濃度，促進骨的礦化。因此，ALP可以作為反映骨形成的標志物。我們通過檢測堿性磷酸酶活性和鈣沉積來比較Ti 和MHCI-Ti 的成骨活性。結果表明，MHCI-Ti 促進hMSC 成骨分化。當hMSC 在MHCI-Ti上培養28 d 后發現，ALP 活性和鈣沉積顯著增加。提示這種材料是骨修復和牙種植體的理想材料。

本研究結果表明，純Ti 種植體表面涂層米諾環素可以增強種植體骨整合，可用于預防種植體周圍炎。然而，常規使用局部抗生素以增強骨整合或預防感染是有爭議的，并可能增加耐藥風險［29］。因此下一步研究有必要對種植體早期感染模型進行分析，以探索米諾環素改性種植體的適應證。