康復訓練通過DCC/APPL-1/AKT通路對缺血性腦卒中大鼠功能恢復和神經(jīng)細胞凋亡影響

2023-02-18 10:39:58郭娜張勃

山東醫(yī)藥 2023年4期

郭娜，張勃

1 天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腦病康復科，天津300193；2 國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學研究中心；3 天津中醫(yī)藥大學體育健康學院

缺血性腦卒中是由于多種原因限制腦部血液供應，導致局部腦組織缺氧和缺血性壞死以及相應神經(jīng)功能缺失的一類臨床綜合征。該病具有高病死率、高復發(fā)率和高致殘率的特點［1］。幸存者中約有一半以上的患者伴有不同程度的后遺癥，包括吞咽障礙、半身不遂、言語不清等［2］。缺血性腦卒中神經(jīng)損傷的機制較多，病因不同，發(fā)病機制、發(fā)病時間和臨床類型等不同，主要實施個體化治療［3］。隨著神經(jīng)可塑性理論的發(fā)展和“治療時間窗”的提出，缺血性腦卒中的早期治療備受關注［4］。目前，溶栓治療是缺血性腦卒中最有效的治療措施，但溶栓時間窗只有3～4 h，很多患者無法滿足此條件，所以，盡可能減少后遺癥成為缺血性腦卒中治療的首要任務［5］。康復醫(yī)學主要治療因疾病或者外傷遺留的功能障礙、生活和工作能力暫時性減弱或喪失，使其功能盡可能地最大限度恢復［6-7］。研究表明，腦卒中的康復治療可有效幫助患者恢復大腦和肢體功能，重返社會［8］。2021 年8 月—2022 年 3 月，我們探討了康復訓練對腦卒中大鼠功能恢復和神經(jīng)細胞凋亡的影響及機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑健康成年Sprague-Dawley （SD）大鼠100 只，體質(zhì)量250～280 g，購于北京維通利華實驗動物有限公司，清潔級，標準的飼料與純凈水喂養(yǎng)，溫度在21～25 ℃，濕度為40%～60%，實驗動物許可證號：SYXK（京）2021-0019。MK2206 試劑（AKT抑制劑）購自美國Sigma-Aldrich 公司；LY294002 購自英國Abcam 公司；DCC、APPL-1、P-AKT 和AKT 一抗購自碧云天生物技術有限公司。

1.2 動物建模隨機抽取80 只大鼠建立大腦中動脈閉塞（MCAO）模型，10%水合氯醛將大鼠麻醉，左心室局部注射LY294002 5 μL，30 min后采用縫合法進行MCAO 建模，用2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠。頸部皮膚乙醇消毒后行正中切開，然后鈍性剝離皮下組織，分離右側鎖骨與胸骨舌肌之間的右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA）。在頸內(nèi)外動脈分叉處結扎頸外動脈，并結扎近心端的頸總動脈。在近端ECA 結扎區(qū)切一個0.25 mm 的孔，距ICA 和ECA 分叉約5 mm 處縫合，從ECA 和分叉18～20 mm 處進入ICA，阻止大腦中動脈（MCA）的進入并結扎ECA 近端部分。2 h 后從ECA 中抽出縫線再灌注。將未行造模的20只大鼠作為假手術組，假手術組大鼠進行類似手術，但線栓不入顱，不阻斷MCA 的血流。在全手術過程，采用加熱墊將大鼠體溫保持在37 ℃左右，待大鼠清醒后放回籠中，同時自由進食和飲水。

1.3 分組和康復訓練 80 只造模大鼠隨機分為自然恢復組、自然恢復+MK2206 組、康復訓練組、康復訓練+MK2206 組，每組20 只。造模48 h，康復訓練組和康復訓練+MK2206 組開始進行康復訓練。自然恢復+MK2206 組和康復訓練+MK2206 組中的大鼠側腦室注射MK2206 試劑。康復訓練步驟：①平衡木訓練：將大鼠置于長1.7 m、寬2 cm 的方棒上爬行，方棒水平放置在支架上，距地面7 cm，該訓練主要評估大鼠的協(xié)調(diào)性、行走能力和平衡能力。②旋轉棒訓練：將大鼠置于長1.5 m、直徑4.5 cm 的圓棒上爬行，圓棒以3 r/min（半徑2.25 cm），順時針和逆時針方向交替旋轉，該訓練主要評價大鼠模型的動態(tài)平衡能力；③滾筒訓練：將大鼠置于長65 cm、直徑60 cm 的訓練模擬器中，中間可分為4 個正方形。訓練裝置兩側固定，一側裝有手搖曲柄，轉速為5 r/min（半徑30 cm），該訓練主要評價大鼠模型的抓握、旋轉等運動能力。該訓練方案7 d/周，2次/d，每次10 min，訓練的前3 d可控制訓練強度。自然恢復組、自然恢復+MK2206 組的大鼠自由飲水和進食，自由活動，均在普通籠中飼養(yǎng)。造模過程中自然恢復+MK2206組死亡2只，剔除實驗。

1.4 大鼠神經(jīng)功能和運動功能評分分別于術后2、7、14、21 d進行神經(jīng)功能和運動功能評分，神經(jīng)功能評分參照Bederson 評分標準，無神經(jīng)功能障礙大鼠為0分；左側前肢屈曲，提起時左前肢不能上抬為1分；行走時左側旋轉為2分；行走時向左側傾倒為3分；不能獨立行走或者昏迷為4 分。運動功能評分依據(jù)平衡木實驗，將大鼠置于30 cm×1.3 cm 的棒上，保持平衡。大鼠站在平衡木上保持平衡為1分；一側爪子握住木條或者在木條上搖晃為2 分；一或者兩個肢體滑下木條為3 分；三個肢體均滑下木條為4分；在平衡木上力爭保持平衡，但滑下為5分；在平衡木平衡失敗，然后跌落為6分；從平衡木上直接跌落為7分。

1.5 大鼠海馬組織DCC、APPL-1、AKT、P-AKT蛋白表達檢測采用Western blotting法。術后14 d，每組取5只大鼠進行海馬組織提取，采用3%戊巴比妥麻醉大鼠，直接斷頭取腦，并分離海馬組織。采用生理鹽水沖洗海馬組織，液氮研磨，轉移到離心管中，加入RIPA裂解緩沖液進行完全裂解，BCA蛋白檢測試劑盒蛋白濃度。用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉膜。采用5%胎牛血清封閉1 h，加入DCC（1∶1 000稀釋）、APPL-1（1∶1 000 稀釋）、AKT（1∶5 000 稀釋）、P-AKT（1∶5 000稀釋）一抗，4 ℃過夜。然后添加相應的山羊抗兔二抗，室溫下孵育1 h，清洗3次，以β-actin為內(nèi)參，采用ECL發(fā)光，暗室內(nèi)顯影、曝光，凝膠成像儀拍照，采用Image J軟件進行灰度值分析。

1.6 大鼠海馬組織中DCC、APPL-1、AKT 陽性表達檢測采用免疫組化法。石蠟切片，烘烤，采用二甲苯脫蠟，依次用100%、95%、75%、50%乙醇依次水化，采用PBS 洗滌。同時加入1 滴過氧化氫，室溫孵育10 min，PBS 洗滌，加入檸檬酸鹽，烘干后，PBS 再次沖洗，加入山羊血清，室溫孵育5 min，脫去血清，加入1∶75稀釋的DCC，1∶100稀釋的APPL-1、1∶100稀釋的AKT一抗，室溫過夜，PBS沖洗3次。取石蠟切片加入生物素標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育15 min，PBS沖洗3次，再將石蠟切片加入過氧化物酶標記的卵白蛋白溶液中，室溫孵育15 min，加入新鮮二氨基聯(lián)苯胺，普通顯微鏡下觀察，蘇木精重新染色，二甲苯脫水，用中性樹脂膠固定，在光學顯微鏡下拍照。隨機選取5個視野，計算陽性細胞數(shù)量，取平均值。

1.7 大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡檢測將各組海馬組織剪成1 mm3左右的碎塊，加入0.25%胰蛋白酶，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化，用20%胎牛血清的DMEM/F12 終止消化，懸浮、離心、過濾，收集細胞。選擇各組神經(jīng)細胞，以每孔2×104個細胞接種在24孔板中。隔夜孵育后，按照制造商說明書，用Annexin V-FITC-PI 凋亡試劑盒染色，在流式細胞儀上進行分析，所有實驗重復3次。

1.8 大鼠海馬神經(jīng)細胞周期檢測取出各組細胞培養(yǎng)液，用PBS 沖洗，0.25%胰蛋白酶溶液消化，始收縮變圓時，取出消化液后與血清混合，停止消化。離心處理，1 000 r/min 離心5 min，去上清液，PBS 清洗，用70%乙醇固定細胞30 min，離心后收集，再次用PBS 洗滌，用1% PI 染色。PBS 洗滌，采用PBS 緩沖液將細胞體積調(diào)整至1 mL，上流式細胞儀中檢測細胞周期情況，每組3個細胞樣本，實驗重復3次。

1.9 統(tǒng)計學方法采用GraphPad Prism9統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布以± s 表示，不同時點均數(shù)比較采用重復測量方差分析，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Dunnett-t 檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 康復訓練對缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)功能和運動功能的影響術后第2 天，其他各組的神經(jīng)功能評分和運動功能評分高于假手術組（P 均＜0.05）；術后7、14 和21 d，神經(jīng)功能和運動功能評分較術后第2 天均出現(xiàn)不同程度的改善，與康復訓練組相比，自然恢復組、自然恢復+MK2206 組和康復訓練+MK2206組的神經(jīng)功能和運動功能評分較高（P均＜0.05），自然恢復+MK2206 組的神經(jīng)功能和運動功能評分高于自然恢復組（P 均＜0.05），康復訓練+MK2206 組神經(jīng)功能和運動功能評分高于康復訓練組（P均＜0.05），康復訓練+MK2206組神經(jīng)功能和運動功能評分低于自然恢復+MK2206 組（P 均＜0.05）。見表1、2。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能情況比較（分 ± s）