升血小板膠囊對小鼠免疫性血小板減少癥的治療作用及其機制

劉建強，侯圣貴，李曉燕，竇愛霞

1 濟南市第四人民醫院關節外科，濟南 250032；2 濟南市第四人民醫院藥學部；3 山東大學第二醫院血液科

免疫性血小板減少癥（ITP）是一種因血小板減少導致的出血性疾病［1］。研究證實，ITP患者存在免疫耐受機制異常，調節T 細胞（Tregs 細胞）的免疫抑制功能降低，血液中循環促炎癥細胞因子水平升高。ITP 治療過程中需要應用免疫抑制劑，如糖皮質激素類藥物。但是老年患者應用糖皮質激素治療過程中，往往出現高血壓、高血糖、骨質疏松、感染等嚴重不良反應。因此，如何減少ITP 患者治療過程中的藥物不良反應十分重要。2020年1月—2022年1月，我們制作ITP小鼠模型并選擇升血小板膠囊治療；通過觀察模型小鼠治療過程中血小板數目、免疫細胞以及炎癥因子的變化，探討升血小板膠囊對ITP的治療作用及減少不良反應的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 4～6周齡雌性C57BL/6J近交系小鼠購自山東大學實驗動物中心，體質量平均為0.020 kg。升血小板膠囊由陜西郝其軍制藥股份有限公司提供（批號：2208116；規格：每盒24粒，每粒0.45 g）。強的松片（每片5 mg）溶于生理鹽水中制成0.45 mg/mL濃度的藥液待用。大鼠抗小鼠CD41（血小板抗體，克隆號MWRG30）購自美國BD 公司，按照產品說明用生理鹽水配制成一定濃度的藥液。小鼠Tregs 細胞分 離 試 劑 盒 購 自Invitrogen 公 司（Carlsbad，CA，USA），小鼠Tregs 細胞流式檢測試劑盒購自eBioscience公司（San Diego，CA，USA）。

1.2 ITP 小鼠模型構建及分組處理 動物實驗依據美國實驗動物資源研究所頒布的《實驗動物飼養和使用手冊》進行，實驗記錄編號為KYLL-2021（KJ）A-0046。將40 只小鼠適應性喂養1 周后，隨機分為對照組、模型組、膠囊組、強的松組，每組10 只。除對照組外，其余三組均用抗血小板抗體于小鼠腹腔內注射，誘導持續性血小板減少成功建立ITP 模型。對照組、模型組按照10 mL/（kg·d）給予生理鹽水灌胃，強的松組按照10 mg/（kg·d）給予相同體積的強的松溶液灌胃，膠囊組按體質量4.5 g/（kg·d）給予相同體積的升血小板膠囊溶液灌胃。各組灌胃均每日1 次，連續8 d。如未經治療，ITP 模型維持時間為4～7周，選擇4周處死動物。

1.3 ITP 小鼠模型外周血小板計數、骨髓液涂片染色 用藥4 周分別處死動物。先摘眼球取血，進行血小板計數測定。然后取右側股骨，分離骨髓，取骨髓液涂片，晾干后做瑞氏-姬姆薩染色。

1.4 小鼠脾臟Tregs細胞構成檢測 采用流式細胞儀檢測。無菌操作取脾臟淋巴結，制備ITP 小鼠單個核細胞懸液，檢測Tregs 細胞構成比例。主要步驟：按照磁珠分選試劑盒步驟取所需體積磁珠移入玻璃試管，加入等體積或至少1 mL 的分離緩沖液，震蕩混勻后在磁場中靜置2 min，棄上清后等體積分離緩沖液重懸磁珠。收集各組脾臟和引流淋巴結提取的單個核細胞，分離CD4+T 細胞。分離到的CD4+T 細胞中加入抗CD25 抗體室溫孵育20 min，預冷，分離緩沖液2 mL清洗，離心、重懸，加入75 μL清洗Flow Comp 磁珠，室溫振蕩孵育15 min。置于磁場中2 min，上清取出后用2 mL 分離緩沖液重懸沉淀，再次置于磁場2 min，棄上清。移出磁場后加入0.5 mL 洗脫液重懸細胞，室溫振蕩孵育20 min。輕柔吹打后移入磁場，靜置2 min，分別計數CD4 細胞和CD4+CD25+T 細胞，CD4+CD25+T 細胞即為Tregs 細胞，計算Tregs 細胞構成比及Tregs/CD4 值。實驗重復3次。

1.5 小鼠脾臟T 細胞IL-2 mRNA、Foxp3 mRNA 檢測 采用流式細胞儀以檢測Tregs 細胞類似步驟檢測小鼠脾臟CD4+CD25-效應T 細胞（即Teff 細胞）。TRIzol 試劑盒提取Teff 細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒操作說明書反轉錄為cDNA，然后進行PCR 擴增，檢測Teff 細胞IL-2 mRNA 表達。實驗重復3 次，每次反應均做空白對照（不加模板的反應系統）以排除污染。同樣方法提取Tregs 細胞的總RNA，檢測Tregs細胞Foxp3 mRNA表達。

1.6 統計學方法 采用SPSS16.0 統計軟件。計量資料符合正態分布用± s表示，多組間比較應用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠外周血小板計數 對照組、模型組、強的松組、膠囊組小鼠外周血小板計數分別為（600.35 ± 145.39）、（123.33 ± 16.24）、（327.66 ± 73.20）、（577.35 ± 76.94）×109/L。與對照組比較，模型組、膠囊組、強的松組小鼠外周血小板計數均有不同程度下降（P 均＜0.05）；與模型組比較，膠囊組、強的松組小鼠外周血小板水平升高（P 均＜0.05）；膠囊組與強的松組比較，外周血小板水平差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 各組小鼠骨髓涂片產板巨核細胞計數 對照組、模型組、強的松組、膠囊組小鼠骨髓產板巨核細胞計數分別為（55.05 ± 5.83）、（26.90 ± 2.49）、（66.27 ± 3.58）、（63.45 ± 3.44）個，與對照組比較，模型組小鼠骨髓產板巨核細胞數下降（P＜0.05）；與模型組比較，膠囊組、強的松組ITP 小鼠骨髓產板巨核細胞數增加（P均＜0.05）。膠囊組、強的松組小鼠骨髓產板巨核細胞數比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 各組小鼠脾臟Tregs 細胞構成及Tregs/CD4值 與對照組比較，模型組小鼠Tregs細胞構成比及Tregs/CD4 值下調（P均＜0.05）；與模型組比較，膠囊組、強的松組小鼠Tresg 細胞構成比及Tregs/CD4 值上調（P均＜0.05）。膠囊組、強的松組小鼠Tregs 細胞構成及Tregs/CD4 比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠Tregs細胞構成比及Tregs/CD4比較（%± s）

表1 各組小鼠Tregs細胞構成比及Tregs/CD4比較（%± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

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2.4 各組小鼠脾臟T細胞IL-2 mRNA、Foxp3 mRNA表達 與對照組比較，模型組Teff 細胞IL-2 mRNA表達量升高（P＜0.05）；與模型組比較，膠囊組、強的松組Teff 細胞IL-2 mRNA 表達量下調（P均＜0.05）。與對照組比較，模型組Tregs 細胞Foxp3 mRNA 表達量降低（P＜0.05）；與模型組比較，膠囊組、強的松組Tregs 細胞Foxp3 mRNA 表達量升高（P均＜0.05）。膠囊組、強的松組T 細胞IL-2 mRNA、Foxp3 mRNA表達量比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠T細胞Foxp3 mRNA、IL-2 mRNA表達比較（± s）

表2 各組小鼠T細胞Foxp3 mRNA、IL-2 mRNA表達比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

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3 討論

研究顯示，ITP 發病機制包括機體自身免疫失調導致的巨核細胞系成熟障礙、血小板生成減少、血小板破壞過多［2］。臨床上可以選用的ITP 治療藥物有糖皮質激素、利妥昔單抗、血小板生成素受體激動劑等［3］。但是以上臨床用藥多伴有各種不良反應發生，且存在耐藥現象，可導致重要臟器出血及臨床療效的下降，因此迫切需要更加安全有效的治療方法。研究證實，ITP 患者中存在免疫系統功能紊亂，其中Tregs 細胞數量及功能降低可導致免疫監視功能下調，單核巨噬細胞破壞血小板增多，是ITP 發生的一個重要病理機制［4］。因此上調Tregs 細胞，提高Tregs 細胞的數量與功能，恢復機體的免疫監視系統；同時抑制Teff 細胞增殖，減少B 細胞分泌產生血小板自身抗體［5］，將為ITP開拓新的治療靶點。

血小板膠囊是一種復方純中藥制劑。君藥是青黛，作用是清熱解毒、涼血消斑；臣藥是牡丹皮，功能是涼血散淤；佐藥為疏風散結之連翹以及收斂止血的仙鶴草；應用甘草調和諸藥，最終達到清熱解毒、涼血止血、散淤消斑之功。動物實驗證明，青黛除清熱解毒涼血、抗癌的作用外，可促進體外培養的小鼠胸腺及脾臟T 淋巴細胞增殖，并且藥量與藥效呈現正量效關系，提示青黛能夠調節免疫系統功能［6］。另有動物實驗證明，牡丹皮和連翹不僅能降低毛細血管通透性，還可以調節機體免疫功能，并且不具有腎上腺皮質激素樣的各種不良反應。佐藥連翹還能阻斷T 淋巴細胞活化并抑制增殖［7］。本研究應用升血小板膠囊治療ITP 模型小鼠，結果顯示治療后小鼠外周血血小板計數增加，伴有Tregs細胞數量及其分泌Foxp3 水平提升，Teff 細胞及其分泌產生的IL-2水平降低。提示升血小板膠囊治療可以顯著提高Tregs 細胞比例及功能，改善機體的免疫監視狀態，對ITP有較好的治療效果。

ITP 患者體內的細胞因子處于失衡狀態［8］。Tregs 細胞本身不分泌IL-2［9］，但可以利用Teff 細胞分泌的IL-2并形成反饋回路來調節免疫系統。在本研究中經升血小板膠囊治療后ITP 小鼠的Tregs 細胞數量增加、功能改善，能夠有效抑制Teff 細胞功能，使Teff 細胞分泌的IL-2 減少，從而恢復免疫耐受，減輕免疫性血小板減少患者癥狀［10-11］。本研究ITP 小鼠的Teff細胞IL-2 mRNA 表達高于對照組，提示ITP 小鼠免疫監視的不足導致免疫逃逸狀態的存在。隨著升血小板膠囊治療后Tregs 細胞比例的升高，IL-2 mRNA 表達明顯降低，提示Teff 細胞的免疫逃逸被成功抑制，從而恢復Tregs細胞的免疫監視功能，促進ITP病理狀態的恢復好轉。

綜上所述，升血小板膠囊通過提高Tregs細胞介導的免疫監視，抑制Teff 細胞功能，減少IL-2 分泌，減輕由此引發的免疫病理異常導致的相關血小板損害，促進免疫耐受，發揮升高血小板的治療作用，對ITP 小鼠有良好療效。