宮頸癌組織中Pax1、LMX1A 表達及其與臨床病理特征和預后的關系

劉皓，楊雯，譚學賢，孫斌，熊漢真

1 廣州醫科大學附屬第三醫院病理科，廣州 510145；2 廣州醫科大學附屬第三醫院婦科

宮頸癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤，在女性中的病死率僅次于乳腺癌［1］。宮頸癌的臨床治療包括手術、放化療等，但疾病早期癥狀不典型，明確診斷時多已處于中晚期，錯失最佳的手術治療時機，患者遠期生存預后較差［2-3］。配對盒基因1（Pax1）屬于配對盒轉錄因子家族成員，包含一個配對盒結構域和一個配對型同源結構域，在胎兒發育過程中起關鍵作用［4］。研究表明，Pax1作為一種抑癌基因，在食管癌、口腔癌等惡性腫瘤中表達降低，其表達下調能夠促進腫瘤侵襲和轉移［5-6］。LIM 同源框轉錄因子1A（LMX1A）屬于同源框轉錄因子家族，能結合到富含GC 堿基的基因啟動子區調節基因轉錄［7］。在胃癌和肺癌等腫瘤中低表達，能抑制腫瘤細胞遷移［8-9］。本研究通過檢測宮頸癌組織中Pax1、LMX1A表達，分析二者的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016 年1 月—2017 年6 月廣州醫科大學附屬第三醫院診治的103 例宮頸癌患者。年齡22～76（60.19 ± 8.71）歲；TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期73 例，Ⅲ期30 例；腫瘤直徑：＜5 cm 62 例，≥5 cm 41 例；浸潤深度：T1～T266 例，T3～T437 例；分化程度：低分化40例，中分化35例，高分化28例；病理類型：鱗癌80 例，腺癌15 例，其他類型8 例；肌層浸潤45 例；淋巴結轉移27 例。納入標準：①患者均行宮頸癌根治手術治療，經病理學診斷確診為宮頸癌；②臨床病理資料完整；③首次診治。排除標準：①重度肝腎功能障礙；②合并其他腫瘤者；③近1個月內有全身性感染性疾病。本研究經過醫院倫理委員會審核通過（20170614）。患者均簽署知情同意書。

1.2 宮頸癌及相應癌旁組織中Pax1、LMX1A 表達檢測 采用免疫組化染色法。宮頸癌及癌旁組織樣本常規中性甲醛固定，梯度脫水后，組織包埋機進行包埋（深圳永年科技公司，型號：YN-02B1）。常規進行免疫組化染色。Pax1 和Anti-LMX1A 抗體購自美國Acam 公司（貨號ab252847、ab82833）。DAB 顯色后脫水、透明和固定，鏡下（美國科特爾公司，型號：BP1500）觀察染色結果。結果判定：陽性細胞數評分：陽性細胞比例≤5%為0 分，5%＜陽性比例＜25%為1 分，25%≤陽性比例＜50%為2 分，50%≤陽性比例＜75%為3 分，陽性比例≥75%為4分。染色強度評分：無色（0 分），淡黃色（1 分），棕黃色（2 分）和棕褐色（3 分），陽性細胞數評分和染色強度評分乘積為最終評分，0～4 為陰性，5～12為陽性［10］。

1.3 隨訪 患者出院后均定期進行電話和門診方式隨訪，第1～2 年每3 個月隨訪1 次，以后每6 個月隨訪1 次。隨訪截至2022 年6 月，隨訪終點為患者死亡或隨訪時間結束。

1.4 統計學方法 采用SPSS23.0 統計軟件。計量資料符合正態分布以±s表示，組間比較采用t檢驗。計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier 法（Log-rank 檢驗）。單因素及多因素Cox 比例風險回歸模型分析影響患者預后的因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌及癌旁組織中Pax1、LMX1A 表達比較 免疫組化結果顯示，Pax1、LMX1A 定位于細胞質和細胞核，棕色染色。103 例宮頸癌組織中Pax1表達陽性41 例（39.81%），癌旁組織中Pax1 表達陽性69 例（66.99%），差異有統計學意義（χ2=15.294，P＜0.05）（圖1A、B）。103 例宮頸癌組織中LMX1A表達陽性40 例（38.83%），癌旁組織中LMX1A 表達陽性71 例（68.93%），差異有統計學意義（χ2=18.773，P＜0.05）（圖1C、D）。

2.2 宮頸癌組織中Pax1 和LMX1A 蛋白表達與患者臨床病理特征的關系 宮頸癌組織中不同TNM 分期和淋巴結轉移患者中Pax1 和LMX1A 蛋白表達陽性率差異有統計學意義（P均＜0.05），不同患者年齡、腫瘤直徑、浸潤深度、肌層浸潤、病理類型和腫瘤分化之間差異無統計學意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 Pax1和LMX1A蛋白表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系

2.3 宮頸癌組織中Pax1 和LMX1A 蛋白表達與患者預后的關系 患者隨訪過程中，死亡46例，失訪2例。Pax1 表達陽性、陰性宮頸癌患者的5 年生存率分別為75.6%（31/41）、38.71%（24/62），差異有統計學意義（χ2=4.386，P＜0.05）。LMX1A 表達陽性、陰性宮頸癌患者的5 年生存率分別為65.0%（26/40）、46.03%（29/63），差 異 有 統 計 學 意 義（χ2=3.487，P＜0.05）。

2.4 宮頸癌患者預后的Cox比例風險回歸分析 以患者是否死亡作為因變量（0=存活，1=死亡），單因素及多因素Cox比例風險分析結果顯示，TNM 分期、淋巴結轉移、Pax1和LMX1A蛋白表達是影響宮頸癌患者預后的因素（P均＜0.05）。見表2、3。

表2 影響宮頸癌患者預后的單因素Cox比例風險回歸分析

表3 影響宮頸癌患者預后的多因素Cox比例風險回歸分析

3 討論

宮頸癌是常見的女性生殖系統惡性腫瘤，發病率在女性惡性腫瘤中排第2 位，僅次于乳腺癌。我國宮頸癌發病率較高，約為12.24/10 萬，且以每年上升0.4%～1.5%的速度升高，病死率達2.64/10萬［11］。宮頸癌治療包括手術、放化療等，但由于腫瘤惡性程度高，術后易出現局部復發及遠處轉移，患者生存預后較差［12］。因此，深入研究影響宮頸癌進展的分子機制，尋找宮頸癌診斷、治療及預后密切相關的生物標記物有重要臨床價值。

Pax1 編碼基因位于20p11.22，該基因編碼Pax1蛋白屬于轉錄因子配對盒（PAX）家族的成員，其參與正常的胚胎發育、椎骨發育等生理學過程。近年研究發現，Pax1 在口腔癌、宮頸癌等腫瘤中表達下調，機制尚不明確，腫瘤中Pax1 發揮抑癌基因作用，其能通過抑制癌基因如c-myc 的表達，抑制腫瘤發生、發展［5-6］。本研究發現，宮頸癌組織中Pax1 蛋白表達明顯下調，分析其原因可能是在宮頸癌中Pax1基因處于高甲基化狀態，Pax1 的啟動子區以及外顯子區域高甲基化會導致RNA 聚合酶無法結合到Pax1 基因上而導致Pax1 基因轉錄異常，最終導致Pax1 基因表達下調［13］。本研究發現，Pax1 表達與TNM 分期、淋巴結轉移相關，原因是Pax1 表達下調參與促進上皮—間質轉化。DENG 等［14］研究發現，宮頸癌細胞的上皮—間質轉化是宮頸癌細胞發生轉移的主要機制之一。Pax1 表達下調可能促進上皮—間質轉化過程，腫瘤細胞表面的纖維蛋白、膠原蛋白和鈣黏蛋白等細胞黏附蛋白大量降解，使得腫瘤細胞黏附功能下降而發生轉移［15-16］。同時，FARHAN等［17］研究發現，Pax1與人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）協同表達。由于PTEN 是磷脂酰肌醇3-激酶信號通路的抑制蛋白，并且基質金屬蛋白酶-1 和基質金屬蛋白酶-9 等均是磷脂酰肌醇3-激酶信號通路的下游靶基因［18］。因此，在宮頸癌中Pax1 表達下調可引起PTEN 表達下調，使得磷脂酰肌醇3-激酶信號通路異常激活，導致基質金屬蛋白酶-1 和基質金屬蛋白酶-9 表達異常，基質金屬蛋白酶通過降解腫瘤細胞外基質促進宮頸癌細胞發生上皮—間質轉化，促進腫瘤轉移。

LMX1A基因位于1q23.3，該基因編碼含有同源結構域和LIM 結構域的蛋白質，其編碼的蛋白質是一種轉錄因子，功能上可作為胰島素基因轉錄的正向調節因子［19］。近年研究表明，在胃癌、結直腸癌等腫瘤中LMX1A表達下調，導致下游β-連環蛋白表達降低，促進腫瘤細胞的無限增殖和侵襲［20］。本研究發現，在宮頸癌組織中LMX1A 蛋白表達明顯下調，分析其原因可能是在宮頸癌中LMX1A 基因啟動子區呈高甲基化狀態，甲基化修飾會抑制轉錄復合體的組裝，導致轉錄起始復合體無法在LMX1A基因啟動子區形成，LMX1A 基因轉錄受到抑制而導致其表達下降。同時，本研究發現，LMX1A 表達與TNM 分期、淋巴結轉移相關。其機制可能是LMX1A作為抑癌基因，能夠抑制腫瘤血管新生及腫瘤轉移。QIAN等［21］研究發現，LMX1A 能抑制血管生成素樣蛋白4的表達。因此，宮頸癌患者LMX1A表達下調會導致其對血管生成素樣蛋白4 的表達抑制作用解除，血管生成素樣蛋白4 表達上調，進而促進腫瘤血管新生，抑制腫瘤細胞凋亡并抑制氧化應激對腫瘤細胞造成的損傷，宮頸癌細胞通過腫瘤血管發生轉移。同時抗凋亡以及抗氧化應激作用能夠提高腫瘤細胞在轉移過程中的存活率，導致宮頸癌患者病情惡化。

本研究中，103 例患者隨訪過程中死亡46 例，5年生存率為55.34%（57/103），低于既往文獻報道[22]。分析原因，一方面是本研究納入的患者年齡較大（平均年齡大于60 歲），且FIGO 分期較高，該部分患者臨床治療難度較大，預后較差，患者的病死率較高；另一方面，本研究樣本量較小，結果可能存在一定的誤差偏倚。本研究進一步分析宮頸癌組織中Pax1和LMX1A 蛋白表達與患者預后的關系，結果發現Pax1 及LMX1A 表達陽性的宮頸癌患者5 年生存率較高，表明Pax1 和LMX1A 蛋白表達檢測有助于判斷宮頸癌患者的生存預后。多因素Cox 回歸分析結果顯示，高TNM 分期、低Pax1和低LMX1A蛋白表達是宮頸癌患者預后的危險因素，提示宮頸癌組織中Pax1 和LMX1A 表達有可能成為新的判斷宮頸癌患者預后的腫瘤標志物，但兩者的具體作用機制有待深入研究。

綜上所述，宮頸癌組織中Pax1 和LMX1A 表達下調，并與宮頸癌患者的TNM 分期、淋巴結轉移相關，檢測二者表達有助于宮頸癌患者的預后預測。