嗅覺受體家族2亞家族W成員3和增殖細胞核抗原在膠質瘤中的表達及相關性研究

張 昕,趙 千,王丹丹,杜 野

(錦州醫科大學附屬第一醫院，遼寧 錦州 121001)

膠質瘤是神經系統常見的腫瘤之一，手術是治療的重要方法，但是近年相關研究顯示術后患者復發率較高，主要與病變無明顯邊界及其浸潤性生長的方式有關[1-2]。病變形成與多種調控基因的改變相關，尤其是增殖和遷移相關的因子[3-4]。嗅覺受體蛋白(Olfactory receptor,OR)是近年關注到的與腫瘤進展有關的因子之一，研究發現OR主要是在嗅覺的神經元中表達，對調控上皮細胞的形成和發育有一定價值。也有學者認為OR家族與高增殖性腫瘤的形成有一定關系，這可能是腫瘤發生的重要分子機制之一[5]。嗅覺受體家族2亞家族W成員3(Olfactory receptor family 2 subfamily W member 3,OR2W3)是家族中對細胞增殖作用最強的因子，也是幼稚嗅上皮組織的標志因子，不僅能調控上皮細胞的發育，還可能對部分上皮的惡性轉變有一定促進作用[6-7]。本研究基于膠質瘤術后標本進行研究，觀察OR2W3和增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表達特征，分析其相關性，探討其對預后的判斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年1月至2015年12月在錦州醫科大學附屬第一醫院確診為膠質瘤的患者作為觀察組。病例納入標準：首次確診行手術治療，并有兩位病理科副主任醫師以上醫師復核病理切片明確診斷，符合WHO中的病理診斷標準。排除術前行放、化療的患者。本組共73例，其中男38例，女35例，年齡43～81歲，平均(62.3±8.3)歲。收集同期因腦外傷需要行顱內減壓術時切取損傷邊緣的腦組織(經兩位病理科副主任醫師以上醫師確診為正常腦組織)標本作為對照組，共73例，其中男37例，女36例，年齡45～79歲，平均(61.6±8.0)歲。本研究經過醫院倫理委員會研究并批準，患者或家屬均簽訂知情同意書。

1.2 研究方法 應用免疫組化En Vision技術檢測膠質瘤組織與正常腦組織OR2W3和PCNA蛋白表達。基于術后石蠟包埋組織進行檢測，切取4 μm的切片，嚴格按免疫組化En Vision技術的操作步驟完成，二抗和DAB購自北京中杉金橋公司，做好質控工作。以預實驗中證實顯色最理想的稀釋濃度(1∶150)進行正式實驗。嚴格按操作步驟進行，設陽性對照和陰性對照，做好質控，減少人為誤差。OR2W3的表達部位在腫瘤細胞的細胞質，PCNA的表達部位是腫瘤細胞的細胞核。應用二維法對OR2W3和PCNA的表達進行評價，即著色強度評分：以無著色、淺黃、黃、棕褐色分別計0、1、2、3分；陽性率評分：先在低倍鏡(100倍)下觀察并選擇3個熱點區，然后在高倍鏡(200倍)計數，計算陽性腫瘤細胞數量/總腫瘤細胞數量×100%，取平均值計為平均陽性率，以平均陽性率<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別評定為0、1、2、3、4分，兩者相乘，分數值范圍為0～12分之間。以≤4分定陰性，>4分定陽性，計算OR2W3或PCNA的陽性率。

1.3 統計學方法 選擇SPSS 17.0統計學軟件進行處理。計數資料以[例(%)]表示，行卡方檢驗；相關分析應用Pearson相關分析；生存分析應用K-M生存分析，并應用Cox回歸模型；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組OR2W3和PCNA陽性表達率比較 觀察組中OR2W3和PCNA的陽性率均明顯高于對照組(均P<0.05)，見表1(圖1、2)。

表1 兩組OR2W3和PCNA陽性率比較[例(%)]

A：膠質瘤中陽性 B：正常腦組織中陰性

A：膠質瘤中陽性 B：正常腦組織中陰性

2.2 膠質瘤不同臨床病理特征中OR2W3和PCNA陽性率比較 OR2W3和PCNA陽性率在不同WHO分級和腫瘤最大徑比較中差異有統計學意義(均P<0.05)，而在不同年齡、性別及有無壞死的比較中無統計學差異(均P>0.05),見表2。

表2 膠質瘤不同臨床病理特征中OR2W3和PCNA表達比較 [例(%)]

2.3 膠質瘤中OR2W3和PCNA表達與患者術后生存時間的關系 納入患者均統計術后60個月的生存時間，截止時間為2020年12月31日。隨訪顯示術后患者生存時間為4～60個月。選擇的臨界值為4分，經K-M生存分析顯示OR2W3(χ2=5.32，P=0.029)和PCNA(χ2=5.32，P=0.029)均與術后生存時間相關，即OR2W3和PCNA高表達者術后生存時間短。Cox回歸模型顯示OR2W3和PCNA的表達是膠質瘤預后的獨立危險因素。見圖3(表3)。

表3 Cox回歸模型對膠質瘤患者的單因素生存分析

圖3 膠質瘤中OR2W3(左)和PCNA(右)表達與患者術后生存時間的關系

2.4 膠質瘤中OR2W3與PCNA表達的相關性 經Pearson相關分析顯示，膠質瘤中OR2W3表達與PCNA表達具有正相關性(r=0.65，P=0.029)。

3 討 論

膠質瘤起源于神經膠質細胞，腫瘤細胞具有異型性，且隨著WHO分級的增加，異型性增大[8-9]，預后差。膠質瘤是高增殖性腫瘤，病變形成中具有基因和遺傳因素的改變。OR基因是在褐家鼠中發現的蛋白，在嗅覺系統形成和炎性損傷時發揮作用。OR基因在結構上具有氨基酸疏水區，N端在膜外側，C端在膜內側，可見到3個環狀的結構域[5]。OR主要表達在幼稚發育的嗅神經上皮細胞質，近年學者發現其胚胎的上皮成份及失控性增生的上皮細胞中也有表達，即細胞的上皮細胞表達升高[10]。OR對增殖的作用及對幼稚上皮的標志作用與腫瘤形成的作用具有相似性[11-12]。Cui等[13]通過檢測OR51E1在神經內分泌癌中的表達，發現OR51E1的表達升高，且其與病變的進展相關，并發現其與SLC18A1具有相關性，干擾其表達可能是治療的潛在靶點。Guo等[14]在胃腺癌中發現OR3A4基因表達升高，且與淋巴結轉移相關，研究認為其可能是轉移的促進蛋白。也有研究認為家族中的成員OR7C1可能是結腸癌干細胞的標志物，OR7C1陽性的結腸癌細胞系的增殖作用更強，永生化作用更明顯[15]。OR2W3是家族中的重要成員，有學者發現OR2W3與胰腺癌進展有關，并在胰腺癌患者不同生物學行為的表達中差異有統計學意義，并認為OR2W3可能是細胞形成中干細胞的標記物之一[7]。因此基于OR2W3在腫瘤性病變的形成和進展中成為研究熱點，由于膠質瘤疾病的進展快，發展迅速，其腫瘤成份較為幼稚，細胞異型性明顯，趨于干細胞的幼稚的特征，OR2W3在膠質瘤中的表達特征可能代表著一類具有明顯幼稚性腫瘤的形態特征。

本實驗發現OR2W3和PCNA在膠質瘤術后組織中高表達，提示OR2W3和PCNA是促進膠質瘤形成的重要分子因素，OR2W3與神經起源的干細胞的作用及癌基因的作用相似，對細胞增生和繁殖有重要促進作用。實驗發現OR2W3和PCNA與腫瘤的病變分級有關，提示OR2W3和PCNA參與腫瘤的進展。OR2W3和PCNA在腫瘤不同增殖指數和腫瘤最大徑的分組中差異有統計學意義，提示OR2W3和PCNA對腫瘤生長有促進作用。研究顯示膠質瘤中OR2W3和PCNA具有正相關性，提示OR2W3對腫瘤進展的作用與OR2W3對增殖的促進作用有關。OR2W3可能具有SOX、Furin、整合素相關因子和基質金屬蛋白酶等[16]的激活序列，促進腫瘤細胞間質網狀纖維的形成。研究認為OR2W3可能具有底物特異性，調節腫瘤細胞的失控性增生及局部浸潤性生長。OR2W3可能是上皮間質轉化的促進因子，這是促進腫瘤細胞遷移的重要因素[17]。本實驗發現OR2W3和PCNA與術后生存時間有關，提示OR2W3和PCNA對判斷預后有價值，但是這需要后續實驗中進行大樣本量觀察隨訪進一步明確。OR2W3高表達還可能引起血管內皮細胞的增殖，為腫瘤細胞的生長提供必要的氧和營養。OR2W3具有干細胞的特征，參與細胞由幼稚向成熟的過程，因此膠質瘤中強表達的常為原始幼稚的干細胞，其具有多向分化潛能，也具有明顯的惡性轉化現象。OR2W3能使細胞“永生化”，呈持續增殖的狀態。OR2W3參與Fos和c-Jun組成的轉錄活化因子二聚體的形成[15]。腫瘤間質中成纖維細胞的增生與OR2W3高表達有關，與促間質形成的因子共同作用，促進腫瘤細胞的侵襲和進展[18-20]。

綜上所述，OR2W3和PCNA在膠質瘤中高表達，兩者具有正相關性，且術后檢測OR2W3和PCNA的表達與預后有關。但是由于OR2W3是近年關注到因子，認識較為淺顯，尤其是其活化后的上游和下游因子的調控網絡是后續實驗中要關注的問題。