紫草素誘導慢性髓系白血病細胞增殖抑制和凋亡的PTEN信號通路研究

吳晉周，靳建旭

(西安市中醫醫院腫瘤科，陜西 西安 710021)

細胞凋亡在包括癌癥在內的疾病的發病機制中起著關鍵作用[1]。腫瘤細胞不易發生凋亡，因為它們激活細胞凋亡信號通路的能力有缺陷。因此，激活腫瘤細胞凋亡途徑是一種有效的腫瘤治療方法[2]。慢性髓系白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是一種與造血組織相關的腫瘤。目前主要以放療、化療和干細胞移植等治療方式為主[3]。目前，CML患者的預后仍然很差，存活率不高[4]。植物、微生物和海洋生物在內的自然產物為發現抗癌藥物提供了豐富的資源。紫草是一種傳統中草藥，可分離出如苯酮類、生物堿類和苯酚類的多種化合物[5]。紫草素是一種萘醌類化合物，主要提取于紫草的根，具有抗菌、抗炎、鎮痛等作用，對細胞的生長也有影響，如能誘導部分腫瘤細胞凋亡，抑制多種腫瘤細胞的生長[6-8]。本研究以人CML細胞K562為靶細胞，以紫草素為誘導劑，研究紫草素對K562細胞的分子作用機制，為抗癌藥物的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 K562細胞(武漢病毒研究所)；健康個體外周血淋巴細胞(重慶巴爾思細胞庫)；紫草素(中國藥品與生物制品檢定所)；MTT試劑盒(美國BD公司)；二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)；Annexin V-FITC/PI試劑盒(美國BD公司)；兔抗人PTEN、p-PI3K多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；鏈霉素、青霉素(上海捷瑞生物工程有限公司)；鼠抗人p-Akt單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；細胞培養液PRMI 1640(美國，Gibgo公司)；胎牛血清(北京元亨圣馬生物試劑公司)；鼠抗人GAPDH單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：使用含有10%胎牛血清，100 U/ml的鏈霉素和青霉素的PRMI 1640培養液培養K562細胞，培養條件為37 ℃、5%CO2。

1.2.2 實驗分組：配制濃度為1 mmol/L的紫草素培養液，然后過濾除菌。將1 mmol/L的培養液稀釋為不同濃度的溶液，分別為10、20、30、40、50 μmol/L。細胞分組為對照組(0 μmol/L紫草素)和紫草素10 μmol/L組、紫草素30 μmol/L組、紫草素50 μmol/L組。

1.2.3 MTT法檢測K562細胞增殖和正常細胞的存活率：以每孔1×105/ml細胞數將對數生長期的K562細胞接種于96孔板內，每孔加入不同濃度的紫草素，然后每個組設置6個復孔，空白對照為不加入紫草素。將細胞放置于培養箱中培養，培養條件為37 ℃、5% CO2，培養時間分別為12、24、48、72 h。預定時間前4 h，每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液，再繼續培養4 h；然后離心棄上清液，再加入DMSO,每孔加入150 μl，震蕩混勻使每個孔中的晶體能夠完全溶解。使用酶標儀于波長570 nm處讀取吸光度(A)值，并根據以下公式計算細胞增殖抑制率和細胞存活率。增殖抑制率=(1-藥物處理組吸光度值/無藥物處理組吸光度值)×100%,正常細胞存活率=(藥物處理組吸光度值/無藥物處理組吸光度值)×100%。使用健康個體外周血淋巴細胞檢測正常細胞存活率，實驗步驟同MTT實驗。

1.2.4 Annexin V雙染法檢測K562細胞凋亡：以1×105/ml將對數生長期的K562細胞接種于96孔細胞板內。在培養24 h后，加入稀釋后的不同濃度(10、20、30、40、50 μg/ml)的紫草素溶液，在未加入紫草素溶液的孔中加入等體積的DMSO。將1 ml細胞懸浮液1000 r/min離心5 min，去上清，再加入RNase，于37 ℃水浴中孵育1 h。然后加入0.5 mg/L碘化丙啶(PI)和Annexin V，放置于冰上，孵育結束后，再使用流式細胞術檢測。再利用CELIQUEST軟件來分析細胞凋亡率。

1.2.5 細胞形態觀察：將培養72 h后K562的細胞進行處理，將細胞分為兩部分，一部分進行細胞涂片，待涂片晾干后使用常規Wright-Gimsa染色，然后在光學顯微鏡下觀察細胞形態；另外一部分細胞制作成切片，使用透射電鏡觀察細胞的超微結構。

1.2.6 Western blot檢測細胞內PTEN、p-PI3K和p-Akt蛋白表達：以5×105個/ml的細胞數將處于對數期的細胞接種于6孔板內，繼續培養72 h后，進行細胞蛋白的提取。獲得蛋白后使用BCA法定量蛋白，然后進行Western blot檢測實驗。使用內參β-actin為對照，根據條帶灰度值判斷蛋白相對表達量，蛋白相對表達量使用目的蛋白灰度值與β-actin比值來表示。

2 結 果

2.1 紫草素對K562細胞增殖抑制率的影響 見圖1。MTT檢測結果顯示，在紫草素濃度為10 μmol/L時，在各個時間觀察點(12、24、48、72 h)，紫草素對K562細胞存活率影響較小，但隨著紫草素濃度的增加，對K562細胞增殖抑制作用逐漸增加；相同濃度的紫草素，隨著作用時間的增加，對K562細胞抑制作用顯著增加，K562細胞存活率顯著降低；紫草素作用時間72 h時，隨著紫草素濃度增加，對K562細胞存活率呈現顯著抑制作用，但當濃度超過30 μmol/L并繼續增加，紫草素對K562細胞存活率影響不再發生明顯變化。所以紫草素的最佳作用濃度為30 μmol/L，最佳作用時間為72 h。實驗結果顯示紫草素呈濃度依賴性抑制K562細胞增殖，同時，隨著作用時間的增加，抑制效果逐漸增強。

圖1 紫草素對K562細胞增殖抑制率的影響

2.2 紫草素對正常細胞存活率的影響 見圖2。隨著紫草素濃度的增高，健康人外周血淋巴細胞的存活率逐漸降低，說明紫草素濃度的增高，細胞毒性增強。當紫草素濃度為30 μmol/L時，72 h的細胞存活率為(90.23±2.50)%，紫草素對外周血淋巴細胞存活率的影響較小。控制紫草素濃度，可以較好的控制紫草素對健康個體外周血淋巴細胞毒性。

圖2 紫草素對健康個體外周血淋巴細胞存活率的影響

2.3 紫草素對K562細胞凋亡的影響 見表1。用不同濃度(10、20、30、40、50 μmol/L)的紫草素作用于K562細胞24 h后，流式細胞儀檢測細胞凋亡比例，K562細胞的相對生存率隨著紫草素濃度的增高而降低(均P<0.05)，這說明紫草素的抑制作用具有濃度依賴性。與0 μmol/L組相比，早期和晚期凋亡率增加明顯，這表明紫草素誘導細胞凋亡的作用也具有濃度依賴性。

表1 不同濃度紫草素作用24 h對K562細胞凋亡率的影響(%)

2.4 紫草素對K562細胞形態學的影響 在對照條件下，未經處理的K562細胞生長良好，骨骼清晰、細胞呈圓形、核仁明顯(圖3A)；紫草素處理72 h后(圖3B)，通過光鏡觀察，發現細胞體積縮小、胞膜起泡的現象；進行Wright-Giemsa染色后,觀察到細胞的染色質濃聚，核裂解及典型的凋亡小體等現象；與未處理的K562相比(圖3C)，在電鏡下觀察到包括細胞濃縮、染色質邊緣化和空泡化等細胞凋亡的形態學特征(圖3D)。

2.5 紫草素對K562細胞PTEN、p-PI3K和p-Akt蛋白表達的影響 見表2。與對照組相比，實驗組的PTEN的蛋白表達量明顯增高，而p-PI3K和p-Akt蛋白表達量明顯降低(均P<0.05)，同時，紫草素對蛋白表達的誘導作用具有濃度差異(均P<0.05)。

A:未經紫草素處理的K562細胞(Wright-Gimsa染色，×100)；B：紫草素處理的K562細胞(Wright-Gimsa染色，×100);C：未經紫草素處理的K562細胞(透射電子顯微鏡，×5000)；D：紫草素處理的K562細胞(透射電子顯微鏡，×5000)

表2 各組細胞PTEN、p-PI3K和p-Akt蛋白表達比較

3 討 論

正常的骨髓產生攜帶氧氣的紅細胞、保護身體不受感染的白細胞和參與血液凝結的血小板[9]。在CML中，骨髓產生過多的白細胞[10-11]，最初，這些細胞的功能相對正常。然而，隨著病情的發展，被稱為成髓細胞(或母細胞)的未成熟白細胞在血液和骨髓中積累。成髓細胞的過度生長會損害其他血細胞的發育，導致紅細胞(貧血)和血小板的缺乏。CML通常發生在60歲以后，常見的癥狀包括過度疲勞、發熱和體重減輕，許多受影響的人會出現脾臟腫大，這可能導致腹部飽腹感和食欲不振。另外，大約一半的CML患者最初沒有任何體征和癥狀，由于其他原因進行血液檢查時才被診斷出來。

研究發現，許多天然化學物質已能誘導腫瘤細胞凋亡，如白芍、蛇床子、人參皂苷、大黃素和姜黃素等均可誘導細胞凋亡[12-13]。紫草素通過抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡。紫草素的主要成分為萘醌類化合物，可對人宮頸癌Hela細胞、大腸癌細胞株CCL229、人胃癌BGC823細胞等起抑制作用[14-16]。紫草素是蛋白質酪氨酸激酶如v-Src和EGFR的非競爭性ATP抑制劑，抑制了腫瘤壞死因子受體相關蛋白1(Tumor necrosis factor receptor-associated protein 1，TRAP1)基因的表達，TRAP1產生可誘導多種腫瘤細胞系的凋亡。李運曼等[17]通過研究紫草素誘導人結直腸癌COLO 205細胞凋亡發現，當細胞色素C被釋放到細胞溶膠中，能夠使Caspase-9和Caspase-3特異性的激活產生聯結反應，誘使細胞凋亡。Caspase-3的激活，誘導PARP和DFF-45的裂解和核酸內切酶的激活。

本研究發現，紫草素對K562細胞生長的抑制作用呈現時間和劑量依賴性。同時，紫草素對健康人外周血淋巴細胞存活率的影響表明紫草素具有一定的細胞毒性作用。控制紫草素的濃度為30 μmol/L，作用時間72 h，紫草素的增殖抑制率效果最佳。形態學上看，紫草素處理后，通過顯微鏡觀察到細胞的收縮和凋亡體，然后通過熒光染色實驗證實了前面的細胞凋亡結論。部分細胞經鏈烷單寧處理后染色體聚集和質膜泡狀，同時可見細胞核斷裂，致密的細胞核可以得出結論，與正常細胞相比發生了凋亡的細胞死亡。以上實驗結果表明，紫草素能夠抑制慢性髓系白血病細胞K562細胞的生長。

PTEN是一個腫瘤抑制基因，是迄今為止發現的第一個具有磷酸酶活性的抑制基因，PTEN的缺失廣泛存在于腫瘤細胞中，是腫瘤患者淋巴結轉移的獨立預后因素[18]。過表達PTEN是治療胃癌的潛在策略。PTEN能負調控Akt信號通路，失活Akt信號通路會抑制癌細胞的增殖和侵襲[19]。研究[20-21]表明，在腫瘤組織中PTEN表達升高會加強負調控Akt信號通路，使p-Akt降低，從而抑制癌細胞增殖，促進其凋亡。Choi等[22]、Pan等[23]發現PTEN抑癌基因的表達能使3-原肌醇環上的磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)產物去磷酸化，導致磷酸磷脂酰肌醇(PI)的生成，從而降低Akt的活化，Akt是一種細胞存活蛋白激酶，通過多種下游效應器介導其活性，導致細胞遷移、細胞周期進展和凋亡抑制。Zhang等[24]研究發現，毛鉤藤堿能夠通過上調肺癌細胞A549中PTEN的表達從而抑制Akt通路的激活，進而抑制肺癌細胞的增殖或凋亡。本研究發現，紫草素能上調細胞PTEN的蛋白表達量，下調p-PI3K和p-Akt蛋白表達量,抑制K562細胞的增殖，促進其凋亡。

綜上所述，紫草素對K562細胞內PTEN/PI3K/Akt通路的活性具有良好的調控效果。