右美托咪定對癲癇大鼠海馬神經元細胞凋亡與Toll樣受體4/核因子κB信號通路的影響

雍 芳，狄政莉，賈曉濤，劉志勤，顧乃兵，郝敏鋒，燕玉娥

(西安市中心醫院神經內科，陜西 西安 710004)

癲癇是臨床常見的一類神經系統疾病，是由于腦神經元異常和過度超同步化放電引起的大腦功能暫時性障礙性疾病[1-2]。癲癇發作能夠造成大腦缺氧，長期反復發作癲癇可造成患者認知功能、記憶功能嚴重降低[3-4]。目前認為癲癇引起的認知和記憶功能減退與神經元細胞凋亡、氧化應激、炎性反應等因素有關[5]。右美托咪定是一種α2腎上腺能受體激動劑，目前被廣泛應用于各種手術和侵入式檢查中，發揮鎮靜和鎮痛作用[6]。有研究[7-8]發現，右美托咪定具有良好的抗炎作用和器官保護作用，能夠減輕心肌缺血-再灌注、肺缺血-再灌注損傷程度，減少相關細胞凋亡，對神經元有一定保護作用。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR-4)/核因子κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路能夠調節多種炎性因子和細胞凋亡相關因子表達[9]。本研究采用氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射制作大鼠癲癇模型，觀察右美托咪定預處理對癲癇模型大鼠海馬神經元細胞凋亡和TLR-4/NF-κB信號通路表達的影響，以期探討右美托咪定在癲癇預防中的效果和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇45只健康雄性SPF級SD大鼠，10～15周齡，平均(12.7±2.1)周齡，體重235～259 g，平均(245.5±9.6)g，均購自川北醫學院，動物生產許可證：SCXK(川)2018-18。試驗開始前適應性飼養1周，飼養室環境溫度為22～25 ℃，相對濕度40%～70%，自然晝夜，分籠進行喂養，每籠5只，標準飼料喂養，自由進食、飲水。保持環境清潔、整潔。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑：鹽酸右美托咪定注射液(國藥準字H20130093)購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)酶聯免疫吸附法檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；RIPA裂解液、BCA試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL化學發光試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；蛋白質Marker購自New England Biolabs公司；兔抗大鼠NF-κB、磷酸化NF-κB(pNF-κB)、離子鈣結合銜接分子1(Iba-1)、Toll樣受體4(TLR-4)和β-actin單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；PVDF膜購自德國Millipore公司。

1.2.2 主要儀器：RT-6100 型酶標儀購自深圳雷杜生命科學股份有限公司；垂直電泳儀、Chemi DOC XRS凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 研究方法

1.3.1 分組及給藥:采用隨機數字表法將大鼠分為A組、B組和C組，各15只。適應飼養1周后給予C組大鼠腹腔注射20 μg/kg右美托咪定，給予A組和B組大鼠腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液，均連續腹腔注射7 d。

1.3.2 動物模型建立:給藥7 d后采用氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射法[4]建立癲癇大鼠模型。B、C組在大鼠清醒狀態下給予腹腔注射127 mg/kg氯化鋰溶液，18～22 h后給予腹腔注射1 mg/kg，30 min后給予腹腔注射30 mg/kg匹羅卡品。觀察大鼠行為表現并進行Racine分級，反復Racine分級評價為Ⅳ級以上視為癲癇持續發作，若持續1 h以上則視為造模成功。若大鼠在注射匹羅卡品后30 min未出現癲癇發作，則每間隔10 min追加腹腔注射10 mg/kg匹羅卡品直至造模成功。一旦成功造模，立即腹腔注射10 mg/kg地西泮終止癲癇發作，若注射后15 min仍未能終止則追加腹腔注射10 mg/kg地西泮。A組大鼠予以注射等體積0.9%氯化鈉溶液注射。

1.3.3 Morris水迷宮測試:建模成功飼養1周后進行Morris水迷宮測試。池內水溫保持在22～26 ℃，加入少量奶粉形成濁液以混淆大鼠視線。將水池等分為4個象限，任意選定一個象限放置平臺(直徑15 cm，位于水下約2 cm)，實驗前1 d將大鼠放入水迷宮中進行適應。①定位航行試驗：為期5 d，將大鼠面向池壁分別從2個入水點放進水中，記錄大鼠找到平臺所用的時間，即逃避潛伏期，如果大鼠在2 min內沒有找到平臺，將逃避潛伏期記為120 s;②空間探索試驗：第6天時撤去平臺，將大鼠從任意一個入水點放入水中，記錄60 s時間內大鼠穿越原平臺所在位置的次數。

1.3.4 酶聯免疫吸附法檢測海馬組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平:斷頭法處死大鼠，立即取腦組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗血跡，取少量海馬組織準確稱重，冰上制備海馬組織勻漿，12 000 r/min離心10 min后分離上清液，檢測其中TNF-α、IL-1β和IL-6水平，所有樣本均進行3次重復檢測，以平均值作為最終結果。

1.3.5 海馬神經元細胞凋亡檢測:取海馬組織經蛋白酶K消化處理1 h，磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)連續漂洗3次，每次5 min，經TUNEL染色后棕黃色或棕褐色為凋亡細胞，于200×倍下計數凋亡細胞數量，計算視野內凋亡細胞所占比例。

1.3.6 Western blot檢測海馬組織NF-κB、pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白表達:取50～100 mg海馬組織準確稱重后放入EP管中，加入RIPA裂解液在4 ℃充分勻漿，4 ℃下12 000 g離心10 min后留取上清液備用。采用BCA試劑盒檢測上清液總蛋白濃度。根據總蛋白濃度取適量上清液進行SDS-PAGE電泳，80 V電泳40 min后轉為110 V繼續電泳70 min，電泳結束后轉移至PVDF膜上，按照目標蛋白分子量大小切取條帶，分別加入NF-κB、pNF-κB、Iba-1和TLR-4一抗，2 ℃過夜孵育。5%脫脂奶粉封閉1 h后加入二抗室溫孵育2 h，ECL顯色并曝光。采用Image J圖像分析系統，以管家基因蛋白β-actin作為參比計算相對吸光度值。

2 結 果

2.1 三組大鼠造模后逃避潛伏期和平臺穿越次數比較 三組大鼠第1～5 天的逃避潛伏期均呈現顯著降低趨勢(均P<0.05)。C組各時間點逃避潛伏期長于A組，短于B組(均P<0.05)。C組大鼠平臺穿越次數少于A組，多于B組(均P<0.05)。見表1。

表1 三組大鼠逃避潛伏期和平臺穿越次數比較

2.2 三組大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平比較 三組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平比較差異有統計學意義(均P<0.05)。B組和C組大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著高于A組，C組大鼠各指標顯著低于B組(均P<0.05)。見表2。

表2 三組大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平比較(pg/mg)

2.3 三組大鼠海馬神經元細胞凋亡比例比較 C組大鼠海馬神經元細胞凋亡比例顯著高于A組，但顯著低于B組(均P<0.05)，見表3。

表3 三組大鼠海馬神經元細胞凋亡比例比較(%)

2.4 三組大鼠海馬組織NF-κB、pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白相對表達水平比較 三組大鼠海馬組織pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白相對表達水平比較差異有統計學意義(均P<0.05)，NF-κB蛋白相對表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。C組大鼠海馬組織pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白相對表達水平顯著高于A組，但顯著低于B組(均P<0.05)。見表4。

表4 三組大鼠海馬組織NF-κB、pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白相對表達水平比較

3 討 論

在我國，癲癇已經成為僅次于腦血管疾病的第二大神經系統疾病，據統計我國現有癲癇患者約900萬，人群總發病率高達7‰，每年新增癲癇發病病例高達22.39～22.8/10萬[10-11]。癲癇發病和發作機制目前尚未完全清楚，但通過腦電圖檢查可以發現多數患者腦部神經存在異常生物放電現象。本研究采用氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射建立癲癇大鼠模型，該種模型與人類癲癇臨床表現和機制相似度高，均可見神經元細胞損傷和凋亡，膠質細胞增生、激活等病理變化。本研究在建模后1周對各組大鼠進行Morris水迷宮測試，結果表明，C組各時間點逃避潛伏期顯著長于A組，但顯著短于B組，C組大鼠平臺穿越次數顯著少于A組，但多于B組。提示相較于正常大鼠，模型大鼠均表現出認知功能和記憶功能減退，經右美托咪定預處理能夠顯著改善認知和記憶功能。

炎性反應是癲癇患者認知功能損傷發生的重要病理和生理基礎，目前研究均發現當發生癲癇后，機體外周血促炎細胞因子和炎性介質表達迅速增加，加重神經損傷程度[12-13]。在造模前給予右美托咪定能夠顯著降低造模后海馬組織中TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平。右美托咪定能夠高特異性地結合中樞神經突觸前膜α2腎上腺能受體抑制去甲腎上腺素(NE)釋放，進而減輕手術引起的應激、損傷，保持血流動力學穩定，右美托咪定具有良好的抗炎和抗氧化作用[14-15]，而癲癇發作損傷認知和記憶功能的可能機制就包括氧化應激、炎癥因子的作用，已經發現右美托咪定對肝、腎等多個重要臟器損傷具有明顯的保護作用。

癲癇發作后炎癥因子的表達和釋放與海馬區星形膠質細胞、小膠質細胞活化密切相關，癲癇發作可刺激小膠質細胞活化，啟動TLR-4/NF-κB信號通路，繼而快速表達和釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子[16-17]。TLR-4是機體監視和識別病原體相關分子模式并啟動天然免疫反應的重要分子，研究發現癲癇發作后，小膠質細胞內的病原體識別受體釋放并被TLR-4識別，激活TLR-4/NF-κB信號通路，并通過級聯放大效應引起炎癥因子的釋放[18]。本研究采用Western blot技術檢測了三組大鼠海馬組織中TLR-4/NF-κB信號通路中關鍵蛋白的表達情況，結果發現三組大鼠海馬組織pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白相對表達水平比較有統計學差異，NF-κB蛋白相對表達水平無統計學差異。C組大鼠海馬組織pNF-κB、Iba-1和TLR-4蛋白相對表達水平顯著高于A組，但顯著低于B組。pNF-κB是NF-κB的磷酸化形式，也是其活化的標志，TLR-4能夠增強NF-κB磷酸化[19]。Iba-1是小膠質細胞活化的標志物[20]。本研究結果提示癲癇發作引起TLR-4表達上調，促進NF-κB磷酸化，pNF-κB表達上調，星形膠質細胞和小膠質細胞活化，進而引起神經炎癥損害和細胞凋亡。同時本研究還發現，C組大鼠海馬神經元凋亡比例顯著高于A組，但顯著低于B組，提示右美托咪定能夠通過抑制TLR-4表達和NF-κB磷酸化，減少星形膠質細胞和小膠質細胞活化引起的炎性因子表達和釋放，減輕神經炎性損傷，減少海馬神經元細胞凋亡。

綜上，右美托咪定不僅可以通過激活TLR-4/NF-κB信號通路抑制癲癇大鼠海馬神經元的炎性反應，還可以通過激活TLR-4/NF-κB信號通路下調炎癥因子表達進而抑制癲癇大鼠海馬神經元細胞的凋亡，從而改善神經功能，發揮神經保護作用。