GA3處理下葡萄果形變化及其生理和分子機制

劉 靜， 董 陽， 農慧蘭， 余 欣， 黃麗媛， 鄭 煥， 陶建敏

(南京農業大學園藝學院，江蘇南京 210095)

葡萄是葡萄科葡萄屬落葉果樹作物，在世界范圍內廣泛種植，其栽培歷史有6 000～7 000年[1]。在我國，葡萄是深受人們喜愛的水果之一，是一種較為暢銷的水果種類，具有較高的經濟價值。葡萄在我國果樹生產中占有至關重要的地位，是加工深度最高和加工產品最豐富的水果之一[2]，其不僅可用于鮮食，還可用于制干、制汁、制醋、釀酒等。近些年來，中國葡萄的種植，無論是栽培面積，還是產量以及品質方面，發展都非常迅猛，中國已成為世界葡萄生產大國[3]。

葡萄果實形狀是葡萄重要的外觀品質，被認為是育種的主要選擇標準之一。根據葡萄果形特性，可將葡萄果粒形狀分為不同的類型，如指形、圓形、卵形、束腰形、彎形等[4-5]。由于消費者喜好不同，果實形狀在很大程度上影響人們對于葡萄品種的選擇。人們會依據果實的大小和形狀來評判其產量、質量以及營養價值等重要的經濟性狀。果實形狀通常用果形指數(果實縱徑與果實橫徑的比值)進行表示[6]。隨著社會的發展，人們的消費習慣也發生了改變，人們越來越不滿足于當前常規的水果果形，在滿足果實內在品質的同時，人們逐漸開始追求一些新奇、獨特的髙品質水果產品。葡萄的果實形狀在一定程度上影響了葡萄的經濟價值及人們的消費選擇[7]。因此，對葡萄果形的研究越來越有必要。

植物激素對果實的生長發育具有重要作用。從花到果的轉變過程中，植物激素如生長素(IAA)、赤霉素(GA3)、細胞分裂素等起到了關鍵作用[8-9]。赤霉素是植物五大激素之一，參與植物許多生長發育過程，例如開花和坐果[10-11]，生長素和赤霉素都是果實發育所需的主要激素[12]。GA3由于具有提高坐果、增大果實和提高品質等方面的作用而被廣泛應用于果樹生產實踐中。研究表明，GA3對果實生長發育的影響主要是通過促進植物細胞分裂和伸長而實現的[13]。此外，GA3處理后能增加生長素的含量，GA3對生長素的調節機制可能是GA3通過促進蛋白質的降解，提高色氨酸的含量，進而促進生長素的合成；并且GA3也可能通過調節結合態生長素轉化為游離態生長素、抑制生長素氧化酶來影響生長素水平[14]。一方面，GA3有調運、吸引營養物質的作用，對果實形狀建成也具有一定的影響[15]，另一方面，GA3還可以對生長素的含量進行調節，說明GA3對果實的生長發育具有顯著的影響[16-17]。

目前已經有研究表明GA3對于葡萄果形具有顯著的調節作用，Dokoozlian等發現GA3的施用可以增加葡萄果實長度[18]；Casanova等在研究中進一步闡述了GA3對葡萄果實形狀的影響主要是通過改變葡萄果實細胞形態而實現的，GA3不影響果實果皮細胞數，但增加果皮細胞直徑[19]；通過施用赤霉素生長抑制劑如2-氯乙基三甲基氯化銨(CCC)，還可以通過抑制赤霉素的合成，從而使果實變小[20]；此外，在其他物種上也有許多GA3對果形具有顯著調節作用的實例，在Chen等的研究中分別對番茄施用GA3和赤霉素抑制劑PAC，結果表明，GA3處理的番茄果實果形指數為1.25，顯著高于對照(1.09)，施用PAC使果形指數降至0.87，說明GA3可以顯著提高番茄果形指數[21]；Wang等在草莓中發現了一種短果形的突變體sf，其研究推測該突變體可能是由于GA3合成途徑的缺乏而導致的[22]。Ahmed等研究發現，在棗樹上施用GA3，可以增加果長和果徑[23]。總之，大量研究結果表明，GA3在調控果實形狀方面具有重要的作用。但現有的研究大多是研究外施GA3對果實外部特征的影響，深入到分子層面上進行探究的研究相對較少，目前對GA3調控果形變化的內部分子機制研究還相對空白。本研究旨在探究GA3對果形影響的內部分子機制，挖掘其潛在的調控基因，為葡萄果實形狀調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料及其處理方法

試驗于2020年在南京農業大學湯山葡萄試驗基地進行，以金手指葡萄為試驗材料。采用平棚架避雨栽培，株行距為3.0 m×6.0 m。土肥水管理及病蟲害防治同常規管理。以花序穗肩的第1個小穗上50%的小花開放為盛花期。于盛花后3 d，選取3株樹勢健壯且相近的金手指葡萄植株，使用25 mg/L GA3溶液對幼果進行處理，每個處理選取60穗左右，并做好標記，以清水作為對照。分別于處理后 6 h、12 h、24 h、48 h、4 d、7 d、14 d采集處理及對照的幼果。處理后7、14 d的樣品置于FAA固定液中，4 ℃保存，用于后續石蠟切片的制作；處理后 6 h、12 h、24 h、48 h、4 d、7 d的樣品立即用液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱中，用于后續總RNA的提取，其中，部分處理后48 h、4 d的樣品用于后續內源GA3、生長素和IAA-ASP含量的測定。

1.2 成熟期葡萄表型觀察

以處理組(T)和對照組(CK)在成熟期的果實為樣品。測量樣品的縱徑和橫徑并計算果形指數，處理組及對照組均含有20個樣品。

1.3 果實細胞的形態觀察

以處理組和對照組在7、14 d時采集的果實為樣品制作成石蠟切片。樣品采集之后立即放在FAA固定液中進行固定，并置于4 ℃下進行保存。樣品以乙醇/二甲苯系列脫水，石蠟包埋，切成3 μm厚的切片，干燥后用甲苯胺藍進行染色。采用正置熒光顯微鏡顯微成像系統觀察細胞形態，測量細胞的縱徑和橫徑并計算細胞指數(細胞縱徑與細胞橫徑的比值)，每次測量使用來自3個不同樣品的3個切片[24]。

1.4 內源GA3、生長素和IAA-ASP含量的測定

以處理組和對照組在48 h和4 d時采集的果實為樣品，采用高效液相色譜電噴霧串聯質譜法(ESI-HPLC-MS/MS)測定樣品內源GA3、IAA和IAA-ASP的含量。樣品洗凈后在液氮中研磨成粉末，稱取0.5 g樣品粉末，加入4 mL提取緩沖液(檸檬酸、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚和甲醇)。4 ℃振蕩過夜后，10 000g離心15 min，取出上清液。沉淀反復浸提2次，合并所得上清液。在4 ℃搖動 1 h，轉速為120 r/min，10 000g離心15 min。然后將上清液在氮氣下干燥，300 μL甲醇(0.1%甲烷酸)復溶，并通過0.22 μm的濾膜。色譜條件：采用poroshell 120 SB-C18反相色譜柱(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)，進樣量為2 μL。質譜條件：噴霧電壓 4 500 V，氣幕、霧化器和輔助氣體壓力分別為15、65、70 psi。霧化溫度為400 ℃，進行3次獨立的生物重復試驗[24]。

1.5 葡萄果實總RNA的提取

以處理組和對照組在6 h、12 h、24 h、48 h、4 d、7 d時采集的果實為樣品，進行總RNA提取，總RNA的提取采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，按照說明書進行操作。取2 μL RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，對RNA樣品的質量進行檢測。用Nanodrop ND-1000分光光度計檢測RNA濃度。

1.6 熒光定量PCR

采用Q5熒光定量儀進行qRT-PCR分析。使用snapgene軟件設計引物，引物見表1。所有引物均使用PCR擴增、電泳以及溶解曲線進行測試，以保證引物特異性。以VvUbiquitin作為內參基因，反應體系按SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa)試劑盒說明書進行操作，進行3個生物學重復試驗，使用2-ΔΔCT公式計算相對表達量[25]。

表1 熒光引物設計序列

1.7 統計分析

用Excel 2010和SPSS 17.0進行統計分析，Adobe Photoshop CC 2019作圖，SPSS進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 GA3處理葡萄成熟期果實形態觀察

如圖1所示，金手指葡萄果實成熟后，使用GA3處理的金手指葡萄外觀出現了明顯的變化：GA3處理的葡萄果形伸長，串型較對照組更為松散，且處理組葡萄果穗變長(圖1-A)；果粒形狀較對照組明顯拉長(圖1-B)，處理組果粒的縱徑為 40.31 mm，顯著大于對照組(28.2 mm)(圖1-C)，但果粒的橫徑無顯著差異(圖1-D)。計算果形指數可知，處理組果形指數為2.58，顯著高于對照組(1.81)(圖1-E)。結果表明，適當GA3處理可以顯著拉長葡萄果實，增加葡萄果形指數。此外，GA3處理對葡萄果穗也具有一定的拉長作用。

2.2 GA3處理葡萄果實組織學觀察

為進一步觀察GA3處理對細胞發育的影響，以處理后7、14 d的金手指葡萄果實為樣品制備石蠟切片。觀察發現，GA3處理的葡萄果實細胞明顯大于對照組，且處理組細胞較對照組明顯拉長(圖2-A、2-B)；相同的視野內處理組所能看到的細胞數明顯少于對照組，說明處理后葡萄果實內部細胞面積增大(圖2-A、圖2-B)。細胞縱橫徑測量結果顯示，處理后7 d，處理組細胞平均縱徑為 49.02 μm，對照組為 32.87 μm；處理后14 d，處理組細胞平均縱徑 121.88 μm，對照組為56.98 μm、處理后7、14 d的金手指葡萄果實細胞縱徑均顯著變大，其中處理后14 d細胞縱徑變化更大，但細胞橫徑變化均不顯著。經計算細胞指數可知，處理后7 d，處理組細胞指數為2.38，對照組為1.67；處理后14 d，處理組細胞指數為2.70，對照組為1.48，細胞指數均顯著增大。這些結果表明，GA3在果實發育早期通過促進細胞膨脹和細胞伸長來增大果實，從而起到拉長葡萄果實的效果。

2.3 GA3處理對金手指葡萄果實中內源赤霉素、生長素和IAA-ASP含量水平的影響

通過ESI-HPLC-MS/MS方法測定GA3處理組和清水對照組樣品中內源赤霉素(GA3)、生長素(IAA)以及IAA-天冬氨酸(IAA-ASP)的含量。結果表明，GA3處理48 h、4 d后，處理組葡萄果實中內源赤霉素含量分別為對照組的4.2、4.3倍(圖 3-A)；GA3處理48 h后，葡萄果實中IAA和IAA-ASP含量開始較對照組升高，且處理后4 d處理組IAA和IAA-ASP含量與對照組之間的差異顯著增大，處理組分別為對照組的2.7、18.4倍(圖3-B、圖3-C)。說明外源GA3處理會使金手指葡萄果實中的內源赤霉素、IAA和IAA-ASP含量升高。

2.4 GA3處理對金手指葡萄果實中生長素生物合成和信號轉導相關基因表達模式變化的影響

為了進一步探究生長素對果實形狀的影響，本研究測定了葡萄果實中生長素生物合成和信號轉導相關基因的表達。YUCCA是生長素合成過程中的關鍵基因，挑選3個YUCCA基因家族的成員VvYUCCA2、VvYUCCA6-1及VvYUCCA6-2進行qRT-PCR檢驗。qRT-PCR結果顯示，與對照組相比，金手指葡萄中生長素合成相關基因VvYUCCA表達量呈升高趨勢，在處理后24 h時達到最高且與對照組含量差異最大。3個基因表達趨勢較為一致。GA3處理后24 h時，金手指葡萄中VvYUCCA2、VvYUCCA6-1表達量為對照組的4～5倍，并隨著時間的推移，處理組與對照組之間的差異逐漸減小，表明GA3處理可能會提高金手指葡萄中VvYUCCA2、VvYUCCA6-1及VvYUCCA6-2基因的表達水平，從而提高生長素的含量(圖4-A、圖4-B、圖4-C)。IAA1是生長素/吲哚-3-乙酸基因家族成員，是一種生長素信號轉錄調控基因，與對照組相比，VvIAA1在處理6 h后表達量無明顯差異，在處理12 h～7d后，表達水平顯著升高。說明GA3處理會影響金手指葡萄中的生長素信號轉導(圖 4-D)。AUX22A和AUX22D是2個生長素響應基因，GA3處理后VvAUX22A表達量較對照組呈升高的趨勢，然而VvAUX22D表達量卻表現出先下降后升高的趨勢，但整體上GA3處理會顯著上調VvAUX22A和VvAUX22D基因的表達。VvAUX22A和VvAUX22D處理組表達量與對照組差異最大的時期都為處理后24 h，此趨勢與3個VvYUCCA基因的表達一致(圖4-E、圖4-F)。

3 討論

葡萄果形是葡萄重要的外觀品質，生產上常用各種植物生長調節劑對葡萄果實形狀進行調節。GA3常在生產上被用于果實品質的調節，是一種應用較為廣泛的植物生長調節劑。但其具體作用機制現在還不明晰，本研究以此為出發點，選擇長形葡萄品種金手指為試驗材料，探究GA3對葡萄果形的影響。結果表明，在盛花期后3 d施用GA3可以顯著拉長金手指葡萄果粒，這與謝周等的研究結果[26]一致。同時，葡萄果穗也有一定程度的拉長，葡萄整體串形更為松散，果粒生長空間大，更適于葡萄生長，這與李蕊蕊等的研究結果[27]一致。依據試驗結果推測，GA3的拉長作用可能不僅限于果實，它對其他植物器官可能也具有拉長作用，并可能通過改變植物組織的內部細胞結構而發揮作用。

GA3已被證實具有促進細胞伸長的作用[28]，但其對葡萄果實的拉長作用是否是通過促進果實內部細胞伸長而實現尚不清楚。因此，本研究選擇GA3處理后7、14 d的果實為樣品制作石蠟切片，觀察果實內部細胞形態，測量細胞縱徑、橫徑并計算細胞指數。結果表明，處理組果實內部細胞確實較對照組大且長；細胞縱橫徑及細胞指數規律進一步驗證了“果實細胞顯著伸長”這一結論，據此可初步驗證GA3對金手指葡萄果形的影響是通過改變細胞形狀而實現的。植物激素共同作用于植物器官生長[29]，赤霉素可能會通過與其他激素共同作用來促進葡萄果實伸長，生長素是與果實發育息息相關的植物激素[30]，IAA-ASP是生長素的主要儲存形式[31]。本研究利用ESI-HPLC-MS/MS方法測定了金手指葡萄果實中的內源赤霉素、生長素和 IAA-ASP 含量。結果表明，GA3處理可以提高果實內源赤霉素、生長素及IAA-ASP含量，這與前人的研究結果[32-33]相近，推測GA3作用于金手指葡萄果實后可能會引起果實內源激素的變化，從而調節果形變化。此外，GA3處理48 h后IAA和IAA-ASP含量差異較小，但處理后4 d的IAA和IAA-ASP含量較對照組差異極顯著，據此推測GA3對IAA和IAA-ASP含量的促進作用可能是在處理后48 h這段時間內逐漸發生的。

YUCCA作為生長素合成過程中的關鍵基因，YUCCA基因的激活或者過表達都會導致游離的生長素含量升高，且YUCCA基因家族多功能冗余，可能需多個基因協同發揮作用[34]。本研究中選擇3個YUCCA基因家族的基因進行qRT-PCR驗證，結果表明3個基因家族表達趨勢基本一致，說明這3個基因可共同作用于生長素的合成。推測GA3處理可以通過提高YUCCA基因表達水平來提高游離態IAA的含量，從而促進果實伸長。處理組與對照組中YUCCA基因的含量及含量差異均在24 h處達到最高值，推測GA3對果實伸長的促進作用可能主要發生在處理后12～48 h之間。根據IAA1的表達趨勢也可以推測GA3處理可能通過影響上游生長素信號轉導物質的含量來調控果形變化。通過 qRT-PCR 技術對2個生長素響應基因AUX22A和AUX22D的驗證推測GA3處理也可能通過影響下游生長素響應基因的表達來調控果形變化。此外，GA3處理后VvAUX22A表達量較對照組呈升高的趨勢，但VvAUX22D表達量卻表現出先下降后升高的趨勢，然而整體趨勢與VvAUX22A相似，推測2種響應基因之間可能存在著先后關系。

4 結論

在金手指葡萄盛花期后3 d，使用25 mg/L GA3溶液浸泡幼果，可顯著拉長葡萄果實，同時果實內部細胞發生膨大且細胞指數變大。外源赤霉素處理可能通過調節葡萄果實中內源生長素的合成和信號轉導途徑來影響葡萄果實形狀。