寧夏釀酒葡萄不同子產區土壤細菌群落特征對比及其影響因子分析

陳曉娟， 李 明

(1.寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021； 2.寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏銀川 750021；3.寧夏大學葡萄與葡萄酒研究院，寧夏銀川 750021)

土壤是葡萄栽培的關鍵因素，提供給葡萄生長發育的必要營養條件。土壤類型、肥力、微生物、溫度、水分等均能影響植株根系的生長和吸收功能。土壤微生物菌群組成及結構的變化與土壤養分含量相關[1]。 微生物群落分布也是土壤肥力狀況的體現，通過制約土壤活性影響根系對養分的吸收利用[2]，從而對土壤養分的有效性起間接影響作用[3]。據調查，土壤的養分狀況和土壤中的微生物含量成正比關系，在做土壤檢測時，通常會將微生物群落特征作為重要的評判標準[4-5]。有研究將土壤微生物區系及多樣性作為生態環境質量的一個重要評價指標[6]。目前，有關土壤微生物的研究已經成為土壤學研究最活躍的領域之一。西班牙、法國、美國等已對其本土的土壤微生物做了廣泛研究[7]。自然環境中僅有約1%甚至更少的微生物具有可培養性[8]，利用傳統技術對土壤微生物進行研究已不能滿足微生物資源的開發和利用。高通量測序技術是近年來應用最普遍的新一代測序技術，具有高通量、高靈敏度和高準確性等特點[9]，為全面認識土壤微生物提供了新的契機[10-11]。

賀蘭山東麓地處寧夏銀川平原西部邊緣(37°43′～39°23′N，105°45′～106°47′E)，賀蘭山沿山以東涵蓋了石嘴山、銀川、吳忠3市，屬中溫帶干旱氣候區。賀蘭山東麓憑借其優越的地理位置和氣候條件，成為中國重要的葡萄酒產區，也是世界最佳釀酒葡萄生態區之一。至2020年，在賀蘭山東麓形成百萬畝葡萄種植長廊，大量荒漠草原開墾為葡萄種植地，地表覆被發生改變，開墾后形成的土壤的物理、化學及生物學性質也都發生了極大的變化[7]。本試驗通過測定甘城子、立蘭、玉泉營、天得4個釀酒葡萄子產區的代表性酒莊葡萄園土壤的理化性質，對比分析不同產區土壤的養分差異；基于Illumina Miseq高通量測序技術，分析4個子產區葡萄園土壤的微生物群落特征，揭示不同產區的細菌群落特征，以期為賀蘭山東麓釀酒葡萄產區土壤微生物資源庫的建設以及葡萄根際微生物資源的篩選和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

以賀蘭山東麓的4個釀酒葡萄子產區代表性酒莊葡萄園土壤為研究對象。采樣地分別為甘城子(GCZ)、立蘭(LL)、玉泉營(YQY)、天得(TD)產區。甘城子產區(38°08′54″ N，105°58′37″ E)，位于吳忠市青銅峽市葉甘公路與233鄉道交匯處北路東，海拔1 123 m，土壤為普通灰鈣土；立蘭酒莊(38°27′38″ N，105°58′20″ E)，位于銀川市永寧縣閩寧鎮原隆村，海拔1 148 m，土壤為礫質灰鈣土；玉泉營西夏王酒莊(38°25′59″ N，106°06′04″ E)，位于銀川市永寧縣玉泉大街，海拔1 092 m，土壤為風沙土；紅寺堡天得酒莊(37°32′09″ N，106°09′16″ E)，位于吳忠市紅寺堡區新莊集鄉西川村，海拔1 403 m，土壤為黃綿土。

1.2 供試材料

分別采集賀蘭山東麓甘城子、立蘭、玉泉營、天得釀酒葡萄園這4個區域的土壤。葡萄品種為3年生赤霞珠(Cabernet sauvignon)。取樣均在2020年9月進行，采集葡萄根際0～20、20～40 cm土層土壤。隨機選取3棵葡萄樹，每個采樣點采取2組土樣并做標記，采土過程避免采取石塊或大塊的土壤。將采取的不同土樣放置冰盒低溫運回實驗室，采用1.00、0.25 mm孔徑的篩子過篩，將篩過的土樣分成2組，一組置于-20 ℃冰箱中保存，用于土壤細菌群落多樣性測定；另一組自然風干，用于理化性質的測定。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤理化性質測定 將風干后的土壤樣品進行理化性質的測定：使用pH計測定pH值，使用電導率儀測定電導率，采用重鉻酸鉀容量法-水合熱法測定有機質含量，采用NaOH堿解-擴散法測定有效氮含量，采用火焰光度計法測定有效鉀含量，采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定有效鉀含量[12]。

1.3.2 土壤DNA提取 采用Mo Bio Power Soil DNA Isolation Kit (Carlsbad，USA) 試劑盒進行土壤中微生物原基因組總 DNA 的提取[13]。將提取的DNA作為模板進行下一步擴增。

1.3.3 PCR擴增 采用細菌16S rDNA V4擴增通用引物進行目標基因PCR擴增，細菌引物為515F(5′-G T G C C A G C M G C C G C G G T A A-3′)和806R(5′-G G A C T A C H V G G G T W T C T A A T-3′)[14]。

1.3.4 土壤細菌群落的測定 采取 Illumina Miseq 高通量測序，獲得土壤樣品的豐度、α多樣性指數、群落結構和群落組成差異。

1.4 數據分析

利用Microsoft Excel 2013進行數據處理，用SPSS 19.0軟件Duncan’s法進行單因素方差分析及Pearson相關性分析。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

4個子產區葡萄根際0～20、20～40 cm土層土壤的化學性質見表1。在葡萄根際土壤0～20 cm土層范圍中，GCZ產區土壤的pH值最大，YQY產區土壤的電導率值最大(P<0.05)，YQY、TD產區土壤的有機質含量顯著大于其他產區(P<0.05)，YQY產區土壤全氮含量亦大于其他產區，有效氮含量4個產區無明顯差異，TD產區有效磷含量最大，GCZ產區有效鉀含量顯著高于其他產區(P<0.05)。在葡萄根際20～40 cm土層土壤范圍中，GCZ產區的pH值顯著高于其他產區(P<0.05)，LL、TD產區電導率值顯著高于其他2個產區(P<0.05)，LL產區有機質含量在4個產區中較高，全氮含量YQY產區最高且顯著高于其他產區(P<0.05)，有效氮含量是LL產區的最高，TD產區有效磷含量顯著高于其他產區，GCZ產區有效鉀含量顯著高于其他產區(P<0.05)。通過對比，0～20 cm土層土壤的養分含量普遍高于20～40土層。

表1 不同產區葡萄根際土壤化學性質對比分析

2.2 土壤細菌群落特征

2.2.1 不同產區的土壤細菌多樣性指數分析 ACE指數、Chao1指數表示群落豐度，指數越高說明群落的豐富度越大；Shannon指數可以用來估計樣本群落的多樣性，經常與Simpson指數一起用于反映α多樣性指數，這2個指數越高表明微生物群落多樣性越高。表2顯示，賀蘭山東麓4個產區葡萄根際土壤0～20、20～40 cm土層的測序覆蓋率在98.23%～98.63%之間，說明該測序樣本的可信度較高。在葡萄根際土壤0～20 cm土層中，GCZ產區的Chao1指數、ACE指數最大，說明在GCZ產區葡萄根際土壤0～20 cm土層中細菌群落豐富度較大。GCZ產區的Shannon指數、Simpson指數在4個產區中最大。在葡萄根際土壤20～40 cm土層中，GCZ產區與TD產區的ACE指數、 Chao1指數較大， TD產區的Shannon指數顯著大于其他產區，該產區的Simpson指數也比其他產區大，說明TD產區細菌群落的多樣性及豐富度較高。

表2 不同產區葡萄根際土壤的細菌多樣性指數

2.2.2 不同產區細菌門水平群落結構組成 由圖1可知，在0～20 cm土層中，細菌豐富度較高的10個門類從高到低依次為變形菌門(Proteobacteria)、未知菌門(unidentified_Bacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、酸桿菌門(Acidobacteriota)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidota)、厚壁菌門(Firmicutes)、黏菌門(Myxococcota)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、芽單胞菌門(Gemmatimonadota)。其中變形菌門(Proteobacteria)是葡萄根際土壤0～20 cm土層中的最優勢菌門，GCZ、LL、YQY、TD這4個產區相對豐度分別為20.89%、24.34%、17.33%、25.88%；同時還在根際土壤測得大量未知門類的菌，其相對豐度分別為20.83%、23.33%、19.10%、16.65%；其次是放線菌門、酸桿菌門等，都占有一定的比例。

由圖2可以看出，賀蘭山東麓4個釀酒葡萄子產區在葡萄根際土壤20～40 cm土層中排名前十的細菌菌門依次是變形菌門(Proteobacteria)、未知菌門(unidentified_Bacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、酸酐菌門(Acidobacteriota)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidota)、黏菌門(Myxococcota)、芽單胞菌門(Gemmatimonadota)、厚壁菌門(Firmicutes)、未知古菌門(unidentified_Archaea)。最優勢菌門仍為變形菌門(Proteobacteria)，GCZ、LL、YQY、TD這4個產區相對豐度分別為19.05%、22.41%、32.35%、22.78；其次是未知菌門，其相對豐度分別為28.7%、17.62%、18.96%、18.14%；放線菌門相對豐度分別為10.98%、23.77%、9.84%、15.09%。

2.2.3 不同產區細菌屬水平群落結構組成 由圖3可知，在葡萄根際土壤0～20 cm土層中相對豐度排名前十的屬分別為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、鏈霉菌屬(Steroidobacter)、MND1屬、幽門螺菌屬(RB41)、Dongia、斯科曼氏屬(Skermanella)、海洋伍斯菌(Woeseia)、未知類菌門(unidentified_Actinomarinales)、農研絲桿菌屬(Niastella)、Clostridium_sensu_stricto_1。優勢菌屬為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)，在TD產區相對豐度最大，為4.37%，其余3個產區的相對豐度分別為：GCZ 1.81%、LL 1.32%、YQY 1.75%；其次優勢菌屬為鏈霉菌屬，GCZ、LL、YQY、TD這4個產區相對豐度分別為2.44%、2.01%、0.80%、2.19%。

如圖4所示，賀蘭山東麓不同產區葡萄根際土壤20～40 cm土層中較高10個屬的細菌分別為MND1屬、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、節核細菌屬(Arthrobacter)、未知類菌門(unidentified_Actinomarinales)、幽門螺菌屬(RB41)、Chryseolinea菌屬、鏈霉菌(Streptomyces)、芽孢菌(Bacillus)、Pontibacter、幾丁質噬菌(Chitinophaga)。其中，MND1為最優勢菌屬，在GCZ、LL、YQY、TD這4個產區相對豐度分別為1.78%、1.76%、2.74%、3.42%，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)相對豐度分別為0.70%、1.00%、2.97%、2.63%，節核細菌屬(Arthrobacter)相對豐度分別為0.70%、4.81%、2.37%、1.28%。

2.3 土壤理化性質與優勢細菌群落門水平的相關性分析

表3表明，不同產區葡萄根際土壤2個土層中，變形菌門與pH值、電導率值等呈負相關，與全氮、有效磷含量呈正相關；未知菌門與電導率值與呈顯著正相關，與有效磷含量呈顯著負相關；放線菌門與電導率值、全氮含量呈顯著負相關；酸桿菌門與有機質含量及全氮含量呈極顯著正相關；擬桿菌門與pH值、有效磷含量呈顯著負相關，與電導率值、有效鉀含量呈極顯著正相關；綠彎菌門與土壤pH值呈極顯著正相關。

表3 不同產區葡萄園土層土壤理化性質與優勢細菌門相對豐度Pearson相關性分析

3 討論

3.1 賀蘭山東麓不同子產區土壤理化性質分布特征分析

土壤養分含量對植株的生長具有重要作用[15]。本研究對賀蘭山東麓釀酒葡萄4個子產區葡萄根際 0～20、20～40 cm土層土壤的理化性質進行分析，結果顯示，玉泉營、天得產區的有機質與全氮含量較高，而有機質含量是土壤肥力的重要指標[16]，因此玉泉營產區葡萄根際0～20 cm土層土壤肥力較高，天得產區20～40 cm土壤肥力較高。該結果源于賀蘭山東麓不同果園施肥量有差異[17]。有研究表明，葡萄最適宜的土壤pH值為 6.5～7.5[18]，本研究所測pH值為8.12～9.00，由此可見4個產區的土壤堿性都比較強，不利于葡萄植株生長。甘城子產區土壤的有效氮、有效鉀含量在4個產區中較高，這是由土壤質地的不同及葡萄栽培過程中養分管理的差異所致[17，19]。

3.2 賀蘭山東麓不同子產區土壤細菌多樣性、群落結構組成及影響因子

本研究基于高通量測序分析賀蘭山東麓不同土壤層細菌群落的結構組成，結果顯示，測序覆蓋率為98.23%～98.63%，在測序具有可信度的情況下，得出4個釀酒葡萄子產區葡萄根際0～20 cm土層土壤中，甘城子產區根際土壤的細菌群落豐富度及多樣性相對較高。有研究表明，有效鉀對α多樣性指數的影響最大[20]，土壤中K+有利于鹽漬化土壤作物和微生物的生長，但是含量過高會產生鹽害效應[21]。而本研究測得在葡萄根際20～40 cm土層土壤中，天得產區的細菌群落豐富度及多樣性指數最大，可能是因為天得產區的有效鉀含量處于較合適范圍。有機質也可以提高土壤微生物的多樣性，可以起到穩定土壤微生態的作用[22]。因此，建議葡萄園適量施用生態有機肥，從而有效調控細菌群落結構，促進葡萄園微生物的多樣性。

土壤理化性質和微生物相互影響，與植株共享一個土壤生態系統[23]。賀蘭山東麓4個釀酒葡萄子產區的優勢菌屬有MND1菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、節核細菌屬，優勢菌門為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門，這與周柳婷等的研究結果[24-25]一致。研究表明，影響細菌群落特征的主要因子是pH值[26]，且大多數細菌最適pH值在6.5～7.6之間[27]。本研究中pH值與大多數細菌門類呈負相關。通常變形菌門為多數鹽堿土壤地的優勢菌門[26]，本研究測得變形菌門為4個產區最優勢菌門，這與李潤根等研究結果[28-29]一致。變形菌門中存在尿素酶，可以促進尿素分解，固定土壤中的氮素，參與土壤物質循環[30]。變形菌門在玉泉營、天得產區的相對豐度相比其他產區高，相對應地，玉泉營、天得產區土壤中全氮含量也較高，經Pearson相關性分析，全氮含量與變形菌門呈正相關，與羅旦等的研究結果[31]一致。放線菌門在立蘭產區的相對豐度較其他產區高。相關研究表明，酸桿菌門細菌可以編碼纖維素酶、淀粉水解酶的基因序列，酸桿菌門可以降解動植物殘體產生有機質等養分，提高土壤肥力[32]。本試驗中酸桿菌門在玉泉營 0～20 cm土層土壤中相對豐度為13.90%，相比其他產區最大；天得產區在20～40 cm土層土壤中相對豐度為11.56%，相比其他產區大；而Pearson相關性分析得出，有機質含量與酸桿菌門呈極顯著正相關，在玉泉營、天得產區葡萄根際土壤中較高，與隋夕然等的研究結果[33]一致。

4 結論

對比賀蘭山東麓4個釀酒葡萄子產區的土壤養分含量，發現不同產區葡萄根際土壤養分均存在差異。其中，玉泉營產區土壤肥力相對較高，4個產區葡萄根際土壤均偏堿性。

不同產區葡萄根際土壤細菌α多樣性指數分析表明，各產區細菌群落結構的差異性較大。甘城子、天得產區細菌群落的多樣性及豐富度相對較高。

賀蘭山東麓4個釀酒葡萄子產區土壤的優勢菌門為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門，優勢菌屬有MND1菌屬、Sphingomonas菌屬、Arthrobacter菌屬。不同產區葡萄根際土壤理化性質與優勢菌門的Pearson相關性分析表明，全氮含量是影響變形菌門的重要因子；有機質與全氮含量是影響酸桿菌門的重要因子；pH值、有效磷含量、電導率值、有效鉀含量是影響擬桿菌門的主要因子；pH值是影響綠彎菌門的主要因子。