枯草芽孢桿菌J22拮抗姜瘟陰溝腸桿菌的效果與機理研究

姜艷鵬， 胡振華， 張翠靜， 隋業偉， 陸洪省

(山東科技大學安全與環境工程學院，山東青島 266590)

姜是一種普遍種植的香辛類保健蔬菜，具有廣泛的醫用效果[1]和較高的經濟價值[2]。但隨著連年種植，種植區姜瘟病的發病率逐年升高[3]，姜瘟病的發生通常認為是由青枯勞爾氏菌[4]引起的，該病原體可以在土壤中存活很久。其發病地塊一般減產10%～20%，嚴重時導致絕產[5-6]，對生姜的種植生產造成了嚴重威脅。

在我國通常采用化學法防治姜瘟病的發生[7]，目前廣泛使用土壤熏蒸劑如甲基溴、棉隆及氯化苦進行土壤消毒，能有效控制土傳病蟲害，但對環境和人體健康都造成了負面影響，因此化學防治姜瘟病的方法正逐步被淘汰[8]。生物防治是化學殺菌劑的一種潛在替代方法[9-10]，篩選對姜瘟病病原菌的拮抗菌株，對生姜的種植具有重要意義[11-12]。枯草芽孢桿菌被認為是應用最廣泛、研究最充分的生防菌之一[13-14]，具有很強的競爭活力，如與鐮刀菌競爭營養物質或分泌抗菌物質來抑制鐮刀菌[15]，且對葡萄灰霉病、稻瘟病等具有良好的抑菌效果，其基因組的4%～5%負責合成抗生素，如環脂肽(LPs)、豐霉素[16]等。

本研究于2020年9月采集山東省安丘市凌河鎮生姜種植基地患病地塊的土樣，并進行病原菌分離，根據16S rDNA與致病性試驗，鑒定其為陰溝腸桿菌。陰溝腸桿菌作為內生菌，在有利于細菌生存或者宿主敏感的條件下，會影響姜根莖的質量，造成其腐爛[17-18]，然而研究枯草芽孢桿菌對陰溝腸桿菌的抑制效果尚未見報道。本研究的主要目的是在實驗室條件下評估枯草芽孢桿菌對陰溝腸桿菌的抑制效果，為后期生物防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料 試驗土樣采自山東省安丘市凌河鎮生姜種植基地(119.07°E、36.36°N)，拮抗菌枯草芽孢桿菌J22為筆者所在實驗室之前分離得到的菌株。

1.1.2 供試培養基 致病菌篩選培養基(LB)：蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母浸粉5 g，瓊脂20 g，水補充至1 000 mL，pH值7.2。蛋白酶培養基：脫脂奶粉100 g，瓊脂15～20 g，水補充至1 000 mL[19]。

1.2 試驗方法

1.2.1 致病菌的分離和鑒定 取發病地塊姜土樣品，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行高通量測序，擴增區域為V3～V4(細菌)[20]。配制土壤梯度浸出液，并在LB固體培養基上涂布培養 48 h，培養溫度為30 ℃，經多次純化培養，共分離到12個菌株，對分離到的菌株進行16S rDNA測序，PCR擴增引物為27F(5′-A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G-3′)和1492R(5′-T A C G G C T A C C T T G T T A C G A C T T-3′)[21]。利用美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI)數據庫對測得的 16S rDNA 進行同源性比對，并通過MEGA 6.0構建系統進化樹，鑒定種屬[22]。

1.2.2 細菌菌株的致病性分析 姜根莖清洗后，用0.5%次氯酸鈉消毒，再用無菌水洗凈。切成 3 mm 厚的薄片，用頂端涂有致病菌菌液的牙簽對薄片進行接種，未涂有菌液的薄片為對照[23-24]，30 ℃ 下靜置培養，觀察其致病性。

1.2.3 枯草芽孢桿菌J22的抑菌能力測定 (1)液體培養抑菌法：將陰溝腸桿菌和枯草芽孢桿菌J22分別在LB液體培養基中振蕩培養48 h，轉速為 120 r/min，培養溫度為30 ℃，得到富集液。取 15 mL 陰溝腸桿菌和枯草芽孢桿菌J22富集液分別加入270 mL LB 液體培養基中進行培養，培養條件同上，每隔6 h在520 nm處測定吸光度，單獨培養陰溝腸桿菌測得的吸光度為對照。利用公式(1)計算抑菌率：抑菌率=(D對照-D處理)/D對照×100%[25]。(2)平板培養抑菌法：分別取 10 μL 枯草芽孢桿菌J22與陰溝腸桿菌富集液均勻涂布在LB固體培養基上，30 ℃培養48 h得到菌落，再用0.6 cm的打孔器取陰溝腸桿菌菌餅置于LB固體培養基中央，同時取枯草芽孢桿菌J22菌餅與陰溝腸桿菌菌餅置于LB固體培養基兩側，每處理重復3皿，30 ℃培養3 d，測量菌斑直徑。利用公式(2)計算抑菌率：抑菌率=[菌落直徑(CK)-菌落直徑(處理) ]/[菌落直徑(CK)-菌絲塊直徑]×100%[26]。

1.2.4 枯草芽孢桿菌J22代謝物測定 蛋白酶檢測：在每張6 mm的滅菌濾紙片上滴枯草芽孢桿菌J22發酵液5 μL，放置在蛋白平板中央，每處理重復3皿，30 ℃培養，觀察有無透明圈產生[27]。紅外光譜測定：分別對陰溝腸桿菌、枯草芽孢桿菌及陰溝腸桿菌和枯草芽孢桿菌(陰溝-枯草)富集液 4 000 r/min、離心5 min，得到沉淀物，60 ℃條件下烘干沉淀物10 h，研磨成粉末并與溴化鉀以質量比1 ∶100的比例混合均勻，壓片制樣，采用Nicoiet 380傅立葉紅外光譜儀在4 000～500 cm-1下進行掃描[25]。

1.2.5 抑菌物質高效液相色譜-質譜聯用儀(LC-MS)測定 分別對陰溝腸桿菌、枯草芽孢桿菌以及陰溝-枯草的共培養液8 000 r/min離心 15 min，收集上清液，用HCl調節pH值為2.0，在 4 ℃ 下過夜，對處理液8 000 r/min離心15 min，得到沉淀物，并用甲醇對沉淀物進行溶解，用NaOH將pH值調至7.0后，8 000 r/min離心15 min，收集上清液，在50 ℃條件下對上清液旋轉濃縮，用甲醇給濃縮液定容至50 mL，采用 LC-MS進行分析[28]。

1.2.6 高通量測序分析 在10 g姜瘟發病土壤中加入20 mL枯草芽孢桿菌 J22培養液，30 ℃培養 7 d，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行高通量分析，擴增區域為 V3～V4(細菌)，對測序結果進行物種分類分析和菌群差異分析，以未加入枯草芽孢桿菌J22培養液的土壤樣品為對照。

2 結果與分析

2.1 陰溝腸桿菌的鑒定

對分離得到的致病菌進行16S rDNA測序，用NCBI數據庫對測得的序列進行同源性分析，并構建系統樹(圖1)。從圖1可以看出，分離菌株與陰溝腸桿菌SN19(JQ904624.1)堿基序列相似度為98%，暫鑒定該分離致病菌為陰溝腸桿菌-SKD(Enterobactercloacae-SKD)。

2.2 陰溝腸桿菌的致病性分析

涂有陰溝腸桿菌-SKD的姜切片以及未涂菌液的切片(對照)，在30 ℃條件下培養14 d，結果如圖2所示。涂有陰溝腸桿菌-SKD的姜片組織內部明顯出現發黃、質地變軟、腐爛病狀(圖2-a)。以無菌水為對照的姜片上未出現變色腐爛等癥狀(圖2-b)。

2.3 枯草芽孢桿菌的抑菌能力測定

2.3.1 液體培養的抑菌效果 對陰溝腸桿菌-SKD單獨培養液以及陰溝-SKD+枯草J22共培養液進行吸光度(D520 nm)測定，繪制生長曲線(圖3)。結果表明，陰溝腸桿菌-SKD最大吸光度為1.173，陰溝-SKD+枯草J22共培養時最大吸光度為0.961，降低了0.212，根據公式(1)計算得到抑菌率為18.07%。

2.3.2 平板對峙 在LB培養基中培養3 d，陰溝腸桿菌-SKD單獨培養時的菌餅直徑為10 cm(圖 4-a)，共培養時菌餅直徑為6 cm(圖4-b)，根據公式(2)得到J22對陰溝腸桿菌-SKD的抑菌率為42.55%。

2.4 枯草芽孢桿菌J22產酶與代謝物質的分析

2.4.1 產酶能力分析 如圖5所示枯草芽孢桿菌J22在蛋白酶平板中培養3 d后，平板中出現明顯透明圈，表明枯草芽孢桿菌J22能分泌蛋白酶，可將奶粉蛋白質降解成小分子可溶性物質。

2.4.2 代謝產物的紅外吸收光譜測定 對枯草芽孢桿菌J22富集液(a)、陰溝腸桿菌-SKD富集液(b)、陰溝-SKD+枯草J22共培養液(c)進行離心，采用紅外光譜測定離心后的沉淀物，測定結果如圖6所示。(a)在1 656.79 cm-1出現吸收峰。(b)在1 654.79 cm-1出現吸收峰，其吸收峰均落在1 700～1 600 cm-1范圍內，為酰胺譜帶Ι，表明樣品中含有肽鍵[29]。(c)的吸收峰移出現在1 651.59 cm-1，表明共培養時分子內氫鍵被破壞，使峰位向低波數移動[29]。相較于(a)和(b)，(c) 代表酰胺基(—CONH—)的吸收峰明顯增強，在1 560.16 cm-1出現明顯吸收峰。(a)在1 231.51 cm-1、(b)在 1 234.51 cm-1出現特征吸收峰，證明樣品中含有脂肽類物質[30]。從(a)的吸收峰1 065.33 cm-1和(b)的吸收峰1 086.53 cm-1移至(c)的吸收峰 1 117.37 cm-1，證明了(c)中谷氨酸/天冬氨酸的羧基側鏈(O—H伸縮)和酰胺基的—NH鍵的存在[31]。從圖6可以看出，(c)在 700～500 cm-1處的寬峰相比于(a)和(b)的紅外光譜圖發生了較明顯的變化，這可能是枯草芽孢桿菌J22產生的脂肽物質給陰溝腸桿菌-SKD帶來了影響[31]。觀察到的峰值與Das等報道的脂肽生物表面活性素的峰值[32-33]相似。脂肽生物表面活性素也產生了類似的紅外吸收模式，并在大致相同的波數位置被吸收[32]。

2.5 抑菌活性物質的LC-MS測定

2.5.1 枯草芽孢桿菌J22單獨培養條件下 對培養5 d后的J22菌液進行離心，收集上清液，利用 LC-MS 對上清液中的抑菌活性物質進行測定，結果如圖7、圖8所示。從圖7可以看出，色譜峰主要出現在13.39、14.32、14.91、16.77 min，結合圖8質譜圖，得到其分子質荷比(m/z)分別為1 008.658 8、1 022.673 9、1 036.689 8、1 036.690 7，根據高學文等的研究[34]推測均為表面活性素。

2.5.2 陰溝腸桿菌-SKD單獨培養條件下 對培養5 d后的陰溝腸桿菌-SKD菌液進行離心，收集上清液，利用LC-MS對上清液的物質進行測定，結果如圖9、圖10所示。在9.52 min處峰主要分子質荷比為946.399 5，在10.14 min處峰主要分子質荷比為727.392 5，通過Xcalibur軟件進行元素組成分析，元素組成為C27H55O13N10，根據劉郵洲等的研究[35]推測質荷比 1 029.533 4為桿菌霉素，質荷比 1 447.714 8為泛革素；10.61 min處峰主要分子質荷比為1 036.689 8，推測其為表面活性素；11.04、12.43 min處主要分子質荷比分別為739.411 3、463.320 7，元素組成分別為 C25H59O15N10、C29H41O2N3，結構有待進一步鑒定。13.51、13.88、14.86 min 處主要分子質荷比分別為994.643 4、1 008.658 6、1 022.674 9，均為表面活性素。

2.5.3 陰溝-SKD+枯草J22共培養條件下 陰溝-SKD+枯草J22共培養5 d后進行離心，收集上清液，利用LC-MS對上清液中的抑菌活性物質進行測定，結果如圖11、圖12所示。10.09、10.67、11.87 min處峰主要分子質荷比為579.341 9、563.346 5、463.320 1，通過Xcalibur軟件進行元素組成分析，元素組成分別為C18H47O11N10、C28H51O11N2、C29H41O2N3，12.28 min處峰主要分子質荷比為463.320 5、503.313 0，元素組成分別為C29H41O2N3、C29H39O3N6；結構有待進一步鑒定。13.57 min處峰主要分子質荷比為683.543 4，元素組成為C27H59O10N10；13.88、14.78、15.36 min處峰主要分子質荷比為 1 008.659 4、1 022.674 5、1 036.690 4，推測其均為表面活性素。

綜上所述，3種培養條件下，均出現表面活性素的離子峰，分子質荷比值相差14，分別為1 008.7、1 022.7 和1 036.7， 證明這3種活性肽均為脂肪酸鏈同系物，且相差1個亞甲基(—CH2)。同時，陰溝-SKD+枯草J22共培養時產生了較多新物質，如 C18H47O11N10、C28H51O11N2、C29H41O2N3、C29H39O3N6、C27H59O10N10，具體結構有待進一步鑒定。

2.6 高通量測序分析

對加入枯草芽孢桿菌J22和未加入枯草芽孢桿菌J22的土壤分別進行高通量分析，結果如圖13所示。加入枯草芽孢桿菌J22的土壤樣品中，在目水平上，假單胞菌目相對豐度升高了14.17百分點，莖桿菌目相對豐度升高了13.97百分點，腸桿菌目相對豐度降低了10.71百分點；在科水平上，假單胞菌科相對豐度升高了23.47百分點，成為優勢菌，莖桿菌科相對豐度升高了13.86百分點，腸桿菌科相對豐度減少了10.71百分點，莫拉菌科相對豐度減少了9.31百分點；在屬水平上，假單胞菌屬相對豐度增加了23.48百分點，成為優勢菌，短鏈單胞菌相對豐度增加了14.28百分點，腸桿菌屬相對豐度減少10.39百分點，不動桿菌相對豐度減少9.31百分點；在種水平上，惡臭假單胞桿菌相對豐度增加了23.06百分點，成為優勢菌，鞘氨醇桿菌相對豐度增加了4.44百分點，陰溝腸桿菌相對豐度減少了10.39百分點。

高通量分析結果表明，枯草芽孢桿菌J22在目、科、屬、種水平上對土壤菌落結構的影響一致，其中假單胞菌、鞘氨醇單胞菌、莖桿菌相對豐度均變大，姜瘟病致病菌(陰溝腸桿菌-SKD)相對豐度出現明顯降低，證明枯草芽孢桿菌J22對土壤中腸桿菌具有抑制作用，具有一定的姜瘟病防治潛力。

3 討論

本研究通過對發病地塊進行病原菌的分離、培養、純化，篩選出1株能夠使姜切片患病的菌株，根據16S rDNA確定姜瘟致病菌為陰溝腸桿菌-SKD。陰溝腸桿菌可在患病玉米、洋蔥[36]、水稻植株等植物中分離出來[37]，同時，陰溝腸桿菌可以作為生姜內生菌，在有利于細菌生存或者宿主敏感的條件下，會影響根莖的質量，造成其腐爛[18]。目前，暫未見對由陰溝腸桿菌引起的姜瘟病進行生物防治的報道。枯草芽孢桿菌抑菌能力強，應用范圍廣。因此，本試驗研究了枯草芽孢桿菌J22對陰溝腸桿菌-SKD的抑制效果，結果表明，枯草芽孢桿菌J22在液體培養、平板對峙試驗中均顯示對陰溝腸桿菌-SKD有一定的抑制作用，同時，蛋白酶作為抑菌物質也在本試驗中通過透明圈得到證明[38]。

表面活性素是已知最有效的抑菌物質之一，可顯著抑制細菌、病毒、真菌、支原體的生長[39]。本試驗通過紅外光譜與LC-MS分析枯草芽孢桿菌產生的脂肽類物質，主要分子質量在460～1 500 u 區間，其中含量最多的為表面活性素。桑建偉等的研究結果顯示，解淀粉芽孢桿菌 BEB17也可以產生表面活性素[40]。Chen等研究發現，解淀粉芽孢桿菌FZB42 產生的脂肽類物質可抑制病原真菌的生長，對由歐文氏菌引起的梨火疫病具有防治效果[41]。目前國內外對表面活性素的研究越來越廣泛，多數研究者認為表面活性素具有很強的抗菌活性，能夠改變細菌的表面疏水性，破壞膜結構，從而導致代謝物質外泄[42]。本試驗中通過傅立葉紅外光譜和LC-MS檢測到枯草芽孢桿菌粗提物中也存在表面活性素，從而從機理上證明了枯草芽孢桿菌對陰溝腸桿菌-SKD具有抑制作用。

通過高通量測序分析土壤中的細菌群落構成，發現加入枯草芽孢桿菌后，陰溝腸桿菌在目、科、屬、種的水平上均有所降低，在土壤中主要的優勢菌為假單胞菌、鞘氨醇單胞菌和莖桿菌，為下一步進行田間試驗提供了理論依據。

試驗表明枯草芽孢桿菌對陰溝腸桿菌-SKD有顯著的抑制作用， 為開發具有環境安全的生物農藥[43]以及姜瘟病防治的實際應用提供了一定的理論基礎和應用前景。

4 結論

本試驗從山東省安丘市分離純化出姜瘟病的致病菌，經16S rDNA和致病性試驗鑒定致病菌為陰溝腸桿菌-SKD，可作為生姜內生菌，引起姜根莖腐爛。通過液體培養和平板對峙試驗，枯草芽孢桿菌J22對陰溝腸桿菌均有抑制效果，抑制率分別為18.07%、42.55%，通過蛋白酶平板的透明圈驗證了枯草芽孢桿菌J22能夠分泌蛋白酶類抑菌物質。枯草芽孢桿菌J22發酵液經離心提取的抑菌物質，經紅外光譜測定為內酯類的環狀脂肽，再經酸沉降，高效液相色譜和質譜鑒定其分子質量范圍為460～1 500 u，有效成分為枯草芽孢桿菌表面活性素。高通量分析枯草芽孢桿菌J22對姜瘟病土壤中的細菌菌群影響，表明加入枯草芽孢桿菌后枯草芽孢桿菌對腸桿菌-SKD在目、科、屬、種水平上的相對豐度分別降低了10.71、10.71、10.39、10.39百分點，且前后優勢菌群沒有發生變化。為后續進行田間試驗提供了理論依據。