EMS誘變對谷子萌發及幼苗生長的影響

閆 鋒

(黑龍江省農業科學院齊齊哈爾分院，黑龍江齊齊哈爾 161006)

谷子(Setariaitalica)起源于我國，據考古遺存證明谷子在我國已經有7 000多年的栽培歷史，在我國悠久的農耕文明中占有重要地位。谷子具有耐瘠薄、營養豐富、耐旱等優點，種植區域主要分布在黃河以北干旱、半干旱地區，是該地區重要的糧飼兼用作物[1-2]。長久以來我國谷子主產區生產上應用的品種不抗除草劑，田間除草主要依靠人工，費時費力，是限制谷子產業化發展的限制因素之一[3]。隨著20世紀90年代，河北省農林科學院在世界上率先創制出并大力推廣抗拿撲凈、咪唑啉酮等不同抗性谷子除草劑品種(冀谷系列)，我國谷子育種及谷子產業迎來了革命性的變革[4-5]。由于目前生產上推廣應用的抗除草劑谷子品種多為夏谷，且生育期普遍較長，因此，選育適合春谷區種植的早熟抗除草劑春谷品種不僅能夠為當地農民脫貧致富提供幫助，而且能夠大力推進當地谷子產業發展。

在長期的人工種植馴化過程中，尤其是近幾十年育種家們對谷子育種目標的趨同化，經過不斷的人工選擇，致使谷子遺傳基礎越來越狹窄，一些特異谷子資源慢慢消失。種質資源是生物多樣性的重要組成部分，是新品種選育和種質創新的重要物質基礎[6]。種質資源創新的手段有多種，傳統的雜交、回交、系圃選擇等方式，育種周期較長，且不易選擇到目標性狀。化學誘變開始于20世紀初期[7]，氮化鈉(NaN3)、甲基磺酸乙酯(EMS)、秋水仙素等化學藥劑在作物誘變育種中得到廣泛應用[8]。其中，EMS是一種最常用的烷化劑，可直接使鳥嘌呤N-7的位置發生改變，從而導致DNA結構產生誘變效果，EMS誘變不僅具有突變頻率高的優點，而且使用成本較低、操作簡單[9]。目前，已經在藜麥、水稻、玉米、大豆等多種作物誘變育種中得到廣泛應用，對推動作物遺傳改良和資源創新起到了重要作用[10]。

目前，有關谷子EMS誘變效應方面的研究報道較少。李顏方等對晉谷21進行不同浸種濃度及時間的誘變處理，結果表明，晉谷21號種子的發芽勢與發芽率均隨著EMS濃度的增大而降低，且莖長和胚根長受抑制，最終確定1.0% EMS處理10 h為晉谷21號種子的最佳誘變條件；M1代植株出現白化苗、黃化苗、分蘗等現象[11]。李偉等采用裂區試驗設計，以誘變時間為主區，EMS濃度為副區，對豫谷1號種子進行誘變處理，研究發現豫谷1號的適宜誘變條件為清水浸種過夜，1.0% EMS處理8 h[12]。

公谷88因適口性好、產量高、外觀品質佳，己成為吉林省的主栽谷子品種，但受生育期限制，難以在黑龍江地區推廣。本研究以抗除草劑春谷品種公谷88為材料，擬通過研究不同浸種時間及EMS濃度對谷子萌發、幼苗生長、幼苗理化指標等產生的影響，從而確定公谷88的EMS誘變適宜條件，以期為創建谷子突變體庫及拓寬中早熟春谷抗除草劑種質資源奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

試驗于2021年在黑龍江省農業科學院齊齊哈爾分院試驗室進行，選取由吉林省農業科學院作物資源研究所選育的公谷88作為試驗材料，該品種2019年通過國家非主要農作物品種登記，EMS誘變劑由美國麥克林公司生產。

1.2 試驗設計

1.2.1 EMS處理方法 選取成熟度好的公谷88種子，用蒸餾水浸種3 h吸脹后瀝干水分備用。用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH值為7.0)配制體積分數分別為0.4%、0.8%、1.2%的EMS溶液，以磷酸緩沖液為對照。每個處理取100粒吸脹后的種子，置于200 mL三角瓶中，每個瓶中加入50 mL不同體積濃度的EMS溶液，置于100 r/min的搖床中均勻搖晃6、10、14 h，重復3次。將誘變處理后的谷種置于水龍頭下沖洗2 h，播種于直徑為10 cm的塑料花盆中(每盆播10粒種子)，播種深度為1.5 cm。然后將花盆置于濕度為60%、溫度為28 ℃、光照—黑暗比為10 h—14 h的人工氣候培養箱內，發芽期間各處理澆水量一致。

1.2.2 種子發芽及幼苗形態指標測定 播種5 d后調查各處理發芽勢、10 d后調查發芽率，出苗 10 d 后在各處理中隨機挑選10株幼苗測量莖長、根長。出苗20 d后統計成苗率，計算公式如下：

發芽勢=播種5 d后發芽數/供試種子總粒數×100%；

發芽率=播種10 d后發芽數/供試種子數×100%；

成苗率=成活苗數/供試種子數×100%。

1.2.3 電導率的測定 取每個誘變處理后的種子50粒，稱質量，用自來水沖洗2 h后，置于小燒杯中，倒入 10 mL 蒸餾水浸泡，30 min后測定種子浸出液電導率，以空白蒸餾水為對照。

1.2.4 生理指標測定 出苗5 d后選取幼苗第1張葉片進行各項理化指標的測定。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法進行測定[13]，過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚法進行測定[14]，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定[15]。

1.2.5 SPAD值測定 出苗后5 d在每個處理中隨機選取10株幼苗，采用日本柯尼卡美能達公司生產的 SPAD-502 型測定儀測定谷子第1張葉片的葉綠色相對含量(SPAD值)。

1.2.6 半致死劑量的確定 參照王兆玉等的分析方法[16]，對谷子成苗率與EMS濃度進行回歸分析，計算不同處理時間下EMS濃度的半致死劑量。

1.3 數據分析

采用Excel 2007對試驗數據進行統計及作圖，采用DPS 7.05軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 EMS處理對電導率的影響

由圖1可知，當EMS濃度為0時，種子浸出液電導率處于較低的水平(電導率<0.1 mS/cm)，經過EMS處理后，種子浸出液電導率相比對照大幅升高，隨著EMS濃度升高及浸種時間延長，電導率也隨之增加，但是總體增長幅度有所放緩，6、10、14 h 3種浸種時間處理下，電導率均在EMS濃度為1.2%時達到最高，分別為0.43、0.56、0.58。說明隨著EMS濃度增加及浸種時間延長，細胞質膜受害嚴重，細胞內物質滲漏。

2.2 EMS處理對谷子萌發的影響

2.2.1 EMS處理對發芽勢的影響 由表1可知，隨著浸種時間延長及EMS處理濃度增加，谷子種子的發芽勢呈逐漸降低的變化規律，均顯著低于對照，說明EMS對谷子種子萌發有抑制作用。在同一浸種時間下，不同濃度EMS處理之間谷子的發芽勢存在一定差異。當處理時間為6 h時，EMS各濃度處理之間的發芽勢均呈顯著性差異；當浸種時間為10 h時，1.2% EMS處理下谷子的發芽勢顯著低于0.4% EMS處理和0.8% EMS處理，0.4% EMS處理和0.8% EMS處理之間差異不顯著；當處理時間為14 h時，0.4% EMS處理與0.8% EMS處理間發芽勢差異不顯著，0.4%濃度處理下發芽勢顯著高于1.2%濃度處理。說明不同浸種時間及EMS濃度對谷子種子發芽勢的影響不同。

2.2.2 EMS處理對發芽率的影響 由表1可知，不同浸種時間及EMS濃度對谷子發芽率有較大影響，其變化規律基本與發芽勢相同，隨著浸種時間延長及EMS濃度增加，發芽率逐漸降低。在同一浸種時間下，不同濃度EMS處理之間谷子的發芽率存在一定差異。當處理時間為6 h時，0.4% EMS處理的發芽率與對照差異不顯著，但是顯著高于0.8%、1.2% EMS處理；當浸種時間為10 h時，EMS各濃度處理之間的發芽率均呈顯著性差異；當處理時間為14 h時， 0.8% EMS處理與1.2% EMS處理間發芽率差異不顯著，但均顯著低于0.4% EMS處理。

表1 EMS處理對谷子發芽的影響

2.2.3 EMS對成苗率的影響及半致死劑量的確定 由圖2可知，不同浸種時間及EMS濃度對谷子成苗率影響較大，其變化趨勢與發芽率大體一致。不同浸種時間下，同一濃度EMS處理下谷子的成苗率存在一定差異。浸種14 h處理下，各EMS處理濃度下的成苗率均大幅低于浸種6 h及10 h處理。以成苗率為因變量(y)，EMS濃度為自變量(x)，通過回歸方程(圖2)統計出公谷88在浸種6、10、14 h下EMS處理的半致死劑量分別為1.01%、0.75%、0.39%。

2.3 EMS處理對谷子幼苗生長的影響

2.3.1 EMS處理對苗高的影響 由圖3可知，谷子種子經過EMS處理后，莖長隨著浸種時間的延長及EMS處理濃度的增加呈逐漸下降的趨勢，但是在相同的浸種時間下，不同EMS處理之間莖長下降的程度不同，在6 h浸種時間下，只有1.2% EMS處理的莖長顯著低于對照，另外2個處理與對照差異不顯著；10 h浸種時間下，0.4% EMS處理的莖長與對照差異不顯著，但顯著高于其他2個處理；14 h浸種時間下，各EMS處理之間均呈顯著性差異。由此隨著浸種時間的延長及EMS處理濃度的增加，谷子地上部生長受到的抑制作用越來越大，1.2% EMS浸種14 h處理下的莖長最小，為5.1 cm，比對照降低43.3%。

2.3.2 EMS處理對根長的影響 谷子經過EMS處理后根長的變化規律與莖長大體一致(圖3)，總體來看谷子根長隨著EMS濃度升高及處理時間延長逐漸受到抑制。在6 h和10 h浸種時間下，0.4%EMS處理下的根長生長受到抑制作用不顯著，與對照差異不顯著，但顯著高于另外2個EMS處理；隨著浸種時間延長，谷子根長受到抑制作用逐漸加大，10 h浸種時間下對照與各處理的根長達顯著性差異。綜合來看，1.2% EMS浸種14 h處理下的根長最小，為8.8 cm，比對照降低51.6%。

2.4 EMS處理對幼苗生理指標的影響

2.4.1 EMS處理對幼苗抗氧化酶活性的影響 由圖4可知，經過EMS浸種處理后，同一浸種時間下谷子幼苗葉片中SOD活性變化規律并不一致，但隨著EMS處理濃度的增加，總體呈逐漸上升的趨勢，在浸種時間為6 h時，SOD活性呈逐漸上升的趨勢，0.4% EMS處理下與對照差異不顯著，但是顯著低于其他處理。10 h和14 h浸種時間下，SOD活性呈先上升后下降的變化趨勢，10 h浸種時間下，SOD活性在0.8% EMS處理下達到最高，但與1.2% EMS處理間差異不顯著。14 h浸種時間下SOD活性在EMS濃度為0.4%時達到最高。總體來看隨著浸種時間的延長SOD活性峰值出現的EMS濃度逐漸降低。

經過EMS處理后POD活性的變化規律與SOD大體一致(圖4)，同一浸種時間下，各EMS處理的POD活性均顯著高于對照。6 h浸種時間下，POD活性隨浸種濃度增加而升高，并在1.2% EMS處理下達到最大值。10 h浸種時間下，POD活性呈先升高后降低的變化規律，POD活性在EMS濃度為0.8%時達到最高，隨后下降，但與1.2% EMS處理差異不顯著。14 h浸種時間下，POD活性同樣呈先升高后降低的變化規律，只是POD活性峰值出現在EMS濃度為0.4%時。

2.4.2 EMS處理對幼苗過氧化產物的影響 由圖5可知，不同的浸種時間下，谷子幼苗葉片中MDA含量隨著浸種時間延長及EMS濃度增加，均呈逐漸上升的變化趨勢。6 h浸種時間下，0.4% EMS處理的MDA含量與對照差異不顯著，但顯著低于其他處理；10 h浸種時間下， 各處理間MDA含量均呈顯著性差異；14 h浸種時間下，0.4%和0.8% EMS處理的MDA含量差異不顯著。所有處理中浸種 14 h，濃度為1.2%時，MDA含量最高，為7.1 μmol/L，顯著高于對照45.8%。

2.5 EMS處理對幼苗SPAD值的影響

葉綠素含量的消長規律是反映葉片生理活性變化的重要指標之一，與葉片光合能力有密切關系。由圖6可知，隨著浸種時間延長及EMS處理濃度增加，公谷88的SPAD值呈逐漸下降的趨勢，除了0.4% EMS濃度下浸種6 h處理下的SPAD值與對照差異不顯著外，其他處理均與對照呈顯著性差異。在1.2% EMS濃度中浸種14 h的SPAD值最低，為19.4，比對照低40.7%。

3 討論與結論

EMS誘變不僅能夠抑制種子萌發，還會抑制幼苗生長。前人的研究結果表明，EMS濃度越高，其溶解的過程中產生的有機酸越多，對種子的毒害作用越強，但是在低濃度EMS處理下脅迫作用較弱[17]。浸種時間和濃度是決定誘變效果的關鍵因素，研究顯示，不同物種對EMS的敏感度不同，這可能與種子的結構、種皮的透水性、種子的大小及種子內部的休眠機制有關。云娜等研究發現，以成苗率達半致死量為衡量標準，1.5% EMS浸種15 h和1.1% EMS浸種21 h可作為EMS誘變蒙農紅豆草建立突變體庫的適宜條件[18]。秦思思等的研究結果表明，EMS濃度為3.0%、處理時間為8 h時，其相對發芽率最接近半致死濃度的相對發芽率，為醉魚草EMS誘變體庫建立的適宜條件[19]。前人利用EMS對谷子也做過一些相應研究，長農35號和豫谷1號的EMS最佳誘變條件是1.0% EMS浸種 8 h[12，20]，本研究以公谷88相對成苗率達到半致死劑量為標準，通過回歸方程計算出公谷88在浸種時間6、10、14 h條件下EMS處理濃度的半致死劑量分別為1.01%、0.75%、0.39%，可作為EMS誘變谷子建立突變體庫的適宜條件。

郭曉珊等對番茄種子進行6種EMS濃度處理，結果表明EMS處理對不同品種番茄的胚軸和胚根生長有明顯的抑制作用[21]。伊風艷等用9種濃度EMS對苜蓿種子進行處理，結果表明，低濃度EMS對苜蓿幼苗高無顯著影響，隨著EMS處理濃度的升高，幼苗生長逐漸被抑制[22]。本研究分析結果顯示，在0.4%EMS濃度下浸種6 h處理下公谷88幼苗的莖長、根長與對照差異不顯著。隨著EMS濃度的增加及浸種時間延長，谷子幼苗生長逐漸受到抑制，1.2%EMS濃度下浸種14 h對公谷88生長抑制程度最嚴重。

植物種子經過不同濃度EMS處理后，細胞膜會受到不同程度的損傷，導致細胞內容物滲漏，而使種子浸出液電導率不同[23]。超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)是植物體內主要的抗氧化酶，植物受到的脅迫，抗氧化酶活性增高，用于清除活性氧，這是植物體對自身的重要保護機制[24]。EMS處理后植物細胞內會發生一些生化反應，產生有害物質，而抗氧化酶可有效地清除這些有害物質，因此，在一定EMS濃度范圍內對種子進行處理，SOD、POD活性會增加，但當EMS濃度過大時，會造成植物細胞失活，從而使SOD、POD活性下降。本研究中SOD、POD活性隨著浸種時間和EMS處理濃度的上升呈先上升后下降的變化趨勢，這與前人的研究結果相一致。

本研究針對EMS誘變的濃度和時間2個因素對谷子種子萌發和幼苗生長的影響做了研究，初步確定了適合公谷88誘變的EMS濃度和時間組合，可為今后建立谷子突變體庫、豐富適宜黑龍江省生態條件谷子育種材料及加快谷子育種進程提供參考。但如何對誘變后的植株進行鑒定分析，如何篩選具有目的性狀的變異植株，需要進一步探究。另一方面，由于本研究中只有1個品種，所有研究結論都只適用于公谷88，其分析結果是否具有普遍性、指導性還須通過進一步研究加以驗證。

EMS處理對谷子種子萌發、幼苗生長、理化指標及存活率具有抑制作用，低劑量處理(0.4%、6 h)下，對公谷88的發芽勢、發芽率、莖長、根長及各項理化指標(POD活性除外)影響不顯著。隨著浸種時間及EMS濃度增加，種子萌發指標與幼苗生長指標與對照相比顯著降低；生理指標中SOD和POD活性隨著浸種時間及EMS濃度增加呈先升高后降低的變化趨勢，MDA呈逐漸升高、SPAD值呈逐漸降低的變化趨勢。以成苗率達到半致死劑量為標準，通過回歸方程計算出在浸種時間6、10、14 h下EMS處理濃度的半致死劑量分別為1.01%、0.75%、0.39%，可作為EMS誘變公谷88建立突變體庫的適宜條件。