食品中生物胺提取技術(shù)的研究進(jìn)展

陳楚翹，劉振民，喻東威，徐斐，袁敏

(1.上海食品快速檢測工程技術(shù)研究中心 上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093；2.光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436；3.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011500)

生物胺(BA)是在動(dòng)植物和微生物代謝過程中形成的低分子含氮化合物[1]。低濃度的生物胺與多種人體生理功能相關(guān)，例如胃酸分泌和調(diào)節(jié)核酸與蛋白質(zhì)，但過量攝入會(huì)引發(fā)不良的生理反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)危及生命[2]。生物胺廣泛存在于天然食物中，但由于不同種類食品中的微生物分布迥異，導(dǎo)致生物胺種類和數(shù)量的差異，同時(shí)食品發(fā)酵及儲(chǔ)存過程會(huì)造成不同程度的生物胺累積。因此監(jiān)測食品生產(chǎn)過程中生物胺含量的變化可以作為評價(jià)食品品質(zhì)和新鮮度的重要指標(biāo)[3]。由于食品中基質(zhì)成分復(fù)雜，容易對生物胺的含量分析造成干擾。根據(jù)生物胺分析方法的技術(shù)需求，必須在檢測前對生物胺樣品進(jìn)行前處理，利用合適的前處理方法進(jìn)行樣品凈化或富集[4-5]，以獲得良好的生物胺提取效率。本文對食品中主要存在的生物胺種類以及生物胺樣品前處理技術(shù)的最新進(jìn)展進(jìn)行了概述。

1 食品中的生物胺種類

生物胺廣泛存在于富含蛋白質(zhì)的食品中。肉制品中豐富的蛋白質(zhì)經(jīng)降解后產(chǎn)生的大量游離氨基酸，在氨基酸脫羧酶作用下導(dǎo)致生物胺大量生成。肉制品中主要存在的生物胺種類有精胺、亞精胺、酪胺等[6-7]。同樣的，由于水產(chǎn)制品極適合微生物繁殖且含有大量易降解的蛋白質(zhì)，故而極易造成生物胺含量超標(biāo)，水產(chǎn)制品中主要存在的生物胺為組胺、腐胺、尸胺等[8-9]。酒類中的生物胺主要存在的生物胺為腐胺、組胺、酪胺等[10-11]，其總含量雖一般低于水產(chǎn)制品，但其中含有的乙醇會(huì)增加生物胺的毒性，故而也是食品安全領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)。深受人們青睞的奶酪，因其中富含大量酪氨酸，在發(fā)酵加工和成熟貯存過程極易產(chǎn)生大量酪胺[12-14]，同樣也是食品檢測的重點(diǎn)對象。

2 食品中生物胺的前處理技術(shù)

由于生物胺具有潛在毒性，準(zhǔn)確快速測定生物胺含量成為了食品安全環(huán)節(jié)不可忽視的內(nèi)容。然而食品中生物胺的檢測較為困難，主要原因在于；①食品基質(zhì)復(fù)雜：人們所喜愛的發(fā)酵食品、肉類、水產(chǎn)類食品給生物胺形成提供了理想環(huán)境，同時(shí)這類食品富含蛋白質(zhì)和脂肪為生物胺檢測增加了難度。檢測基質(zhì)復(fù)雜的樣品，需要經(jīng)過提取、凈化等步驟，從而得到準(zhǔn)確測定生物胺的含量；②常用的檢測方法所結(jié)合的前處理步驟繁瑣：生物胺既無熒光特性，也無紫外吸收基團(tuán)，故而無法通過紫外或熒光儀進(jìn)行檢測，因此生物胺檢測方法主要是色譜法，例如高效液相色譜(HPLC)[15]、氣相色譜-質(zhì)譜分析(GC-MS)[16]等，但提取得到的樣品還需經(jīng)過衍生化前處理后才能分析。其他方法諸如毛細(xì)管電泳及生物傳感器法[17]等可以省略衍生化步驟而直接分析生物胺含量。但毛細(xì)管電泳法對樣品的純度要求高，只適用于酒類等基質(zhì)簡單樣品中生物胺含量的測定。經(jīng)典前處理方法例如液液萃取通常使用有機(jī)溶劑提取生物胺，有機(jī)溶劑會(huì)導(dǎo)致酶失活，故而也無法聯(lián)用以酶等作為生物探針來對生物胺分析的生物傳感器檢測法。因此發(fā)展新型的前處理方法對于提高生物胺的檢測能力極為重要。近年來隨著綠色分析技術(shù)的發(fā)展，許多新型前處理方法不斷涌現(xiàn)。本文對近年來生物胺的前處理方法進(jìn)行簡要概述。

2.1 液相萃取

2.1.1 液液萃取 液液萃取是根據(jù)目標(biāo)待測物質(zhì)的溶解度差異，從而達(dá)到分離純化的前處理方法。液液萃取是國內(nèi)外提取生物胺的公認(rèn)方法，在生物胺的測定國標(biāo)[18]中用正丁醇/三氯甲烷混合試劑萃取生物胺，高效液相色譜法定量分析。雖然該方法適用于大部分食品，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，但步驟極為繁瑣，整個(gè)前處理過程耗時(shí)4 h以上。部分學(xué)者在液液萃取的基礎(chǔ)上對其進(jìn)行了改進(jìn)。Francisco等[19]采用鹽析輔助液液萃取技術(shù)凈化酸奶中的生物胺，加入硫酸銨進(jìn)行鹽析反應(yīng)，加速向有機(jī)相轉(zhuǎn)移，縮短了萃取時(shí)間，獲得了較高的提取回收率。傳統(tǒng)液液萃取多消耗大量高毒有機(jī)溶劑[20]，無法與綠色新型檢測方法聯(lián)用，而與色譜技術(shù)聯(lián)用又需進(jìn)行衍生化處理，時(shí)間冗長。隨著近年來樣品處理技術(shù)的不斷發(fā)展，液液萃取逐漸克服有機(jī)溶劑消耗量大、操作復(fù)雜的缺點(diǎn)，許多新技術(shù)基于液液萃取的原理不斷涌現(xiàn)。

2.2 固相萃取

2.2.1 傳統(tǒng)固相萃取 固相萃取是提取食品中生物胺的常用方法之一[24]。其原理是取用選擇性強(qiáng)的固體吸附劑例如十八烷基、石墨碳、苯基等來吸附復(fù)雜基質(zhì)中的待測化合物，使其達(dá)到與雜質(zhì)分離的效果，隨后通過加熱或者洗脫液洗脫解除吸附，從而實(shí)現(xiàn)凈化與富集樣品的目的。Liu等[25]建立了固相萃取-高效液相色譜法測定奶酪和香腸中的6種生物胺，先使用鹽酸和高氯酸提取奶酪和香腸中的生物胺，然后采用Oasis?MCX cartridge固相萃取柱對提取物進(jìn)行凈化，隨后進(jìn)行色譜檢測。該方法中奶酪生物胺回收率達(dá)到91.0%～99.1%，香腸中生物胺回收率達(dá)到90.3%～95.4%，較好地實(shí)現(xiàn)了富含蛋白質(zhì)和脂肪的食品中生物胺的分離。相較于液液萃取，固相萃取無需選擇兩種不相溶的試劑，也不會(huì)產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，但萃取效率會(huì)伴隨著固相萃取材料的使用次數(shù)增加而下降。因而需要發(fā)展更高效、具有特異性的填料。

2.2.2 分子印跡固相萃取 分子印跡固相萃取[26]是在固相萃取基礎(chǔ)上發(fā)展而來的新型萃取技術(shù)，以印跡聚合物(MIP)為填料，解決了傳統(tǒng)萃取材料特異性能差等缺點(diǎn)，且聚合物制備簡單，重復(fù)利用率高。Li等[27]首次將分子印跡固相萃取與絲網(wǎng)印刷電極檢測技術(shù)聯(lián)用來檢測血清和牛奶中的酪胺，以酪胺為模板分子制備印跡聚合物，在電極上涂層修飾MIP進(jìn)行檢測，得到牛奶中的酪胺回收率為 99.6%～102.4%，對酪胺具有強(qiáng)選擇性，滿足檢測需求。然而分子印跡技術(shù)依然存在不足，主要問題在于印跡聚合物在水環(huán)境下的選擇能力較差，水相萃取效果差。目前的解決方向主要集中于：①多步萃取，避開水相萃取；②用有機(jī)溶劑在填料表面形成有機(jī)物保護(hù)殼，從而保護(hù)具有識(shí)別功能的官能團(tuán)，增強(qiáng)水相萃取能力。 隨著分子印跡固相萃取技術(shù)的不斷發(fā)展，許多新模式分子固相萃取應(yīng)運(yùn)而生，例如磁性分子印跡聚合物微球萃取技術(shù)、分子印跡基質(zhì)固相分散萃取等，其可能成為未來最具發(fā)展?jié)摿Φ那疤幚砑夹g(shù)之一。

2.2.3 固相微萃取 固相微萃取與固相萃取原理相似，但樣品的前處理操作有很大差異。微萃取是集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體的無溶劑處理技術(shù)，基于不同涂層材料的纖維或金屬絲來達(dá)到萃取、濃縮樣品中待測物質(zhì)的目的。整個(gè)過程包括吸附和解吸兩步。具有涂層材料的金屬絲或萃取纖維首先在適當(dāng)溶劑中進(jìn)行探針的活化以去除表面雜質(zhì)，隨后將探針放入樣品中萃取目標(biāo)物，萃取完成后將探針放入水等溶劑中沖洗去吸附層表面的干擾物，最后吸附目標(biāo)物質(zhì)的探針直接插入氣相等儀器的進(jìn)樣口進(jìn)行測定。Papageorgiou等[28]優(yōu)化了固相微萃取過程中的萃取纖維類型、提取時(shí)間、解吸過程、pH等因素，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法完全滿足葡萄酒產(chǎn)業(yè)中的生物胺分析。整個(gè)過程中固相微萃取無需有機(jī)溶劑，對環(huán)境危害程度小，但目前發(fā)展過程中固相微萃取仍存在以下問題：①纖維萃取針頭脆弱易斷且無法多次使用，雜質(zhì)容易在上面吸附影響提取效果；②萃取纖維造價(jià)昂貴，目前可以商品化的纖維屈指可數(shù)，限制了日常應(yīng)用，故而固相微萃取技術(shù)仍需在萃取纖維方面進(jìn)行深度優(yōu)化研究，未來隨著性能更佳、成本更合理的萃取纖維頭的出現(xiàn)，必將提高固相微萃取應(yīng)用過程中的穩(wěn)定性和使用重復(fù)性。

2.2.4 基質(zhì)輔助固相分散萃取 基質(zhì)輔助固相分散萃取與傳統(tǒng)樣品前處理方式不同，樣品的提取及凈化流程是同時(shí)進(jìn)行的。分散劑例如硅藻土、硅膠、C18等與粉碎后的固體樣品碾磨充分，隨后作為填料裝柱，在淋洗劑的作用下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的分離，具備同時(shí)分析多種樣品、平衡時(shí)間短、萃取效率高等優(yōu)點(diǎn)。Milheiro等[29]采用基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)凈化富集酒類樣品中的生物胺，該法向樣品中加入Dowex?50W X8吸附劑，隨后采用氫氧化鈉溶液洗脫，結(jié)果表明該法能準(zhǔn)確測定對133～509 μg/L內(nèi)的生物胺。基質(zhì)輔助固相分散無需進(jìn)行離心、過濾等操作，在一定程度上避免了樣品的損失。但該方法不易進(jìn)行廣泛推廣，主要受制于人為因素導(dǎo)致填裝技術(shù)的差異及研磨的顆粒大小不同。

2.2.5 吸附分離 吸附提取是一種低能耗的固相萃取技術(shù)，利用一些高分子聚合材料吸附干擾物質(zhì)從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的純化。聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，因其呈多孔不規(guī)則團(tuán)塊狀，比表面積與微孔面積大，吸附能力強(qiáng)，常被用來處理基質(zhì)簡單的液體樣品。Daniel等[30]建立了一種PVPP吸附結(jié)合毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜的檢測方法，測定酒類樣品中的多種生物胺，首先將PVPP(0.5 g)與酒類樣品(10 mL)混合，均質(zhì)離心處理后再通過0.45 μm再生纖維素膜(Agilent P/N 5190-5284)進(jìn)一步除去干擾物，隨后進(jìn)行分析測定。該方法對生物胺的回收率達(dá)到了87%～113%，檢測限低至1～2 μg/L，適用于酒類樣品中生物胺的檢測需求。PVPP吸附處理時(shí)間基本能控制在10 min以內(nèi)，操作步驟簡單，滿足綠色檢測需求，但PVPP應(yīng)用領(lǐng)域較窄，多用于吸附多酚物質(zhì)，對其他干擾物質(zhì)的吸附率較低。未來吸附提取發(fā)展趨勢將是根據(jù)待測物的結(jié)構(gòu)開發(fā)出更多高效的吸附劑，從而實(shí)現(xiàn)對不同物質(zhì)的凈化。

2.3 電膜萃取

與傳統(tǒng)消耗大量有機(jī)溶劑的前處理方法不同，Pedersen-Bjergaard等[31]在2006年提出的電膜萃取前處理方法，可以大量減少甚至避免有機(jī)溶劑的使用。電膜萃取是以電場為驅(qū)動(dòng)力的萃取手段，使用酸堿等試劑調(diào)節(jié)pH使目標(biāo)物以離子形式存在，帶電目標(biāo)物質(zhì)在電場驅(qū)動(dòng)下通過有機(jī)溶劑形成的極薄支撐液膜(SLM)到達(dá)接受相溶液，從而實(shí)現(xiàn)樣品的凈化與富集，原理見圖1。Zarghampour等[32]使用芯片電膜萃取技術(shù)凈化富集香腸中的生物胺，前處理過程僅需30 min，提取回收率>95%，完全滿足食品中生物胺的檢測需求。目前許多學(xué)者將電膜萃取與其他前處理方法聯(lián)用，彌補(bǔ)單一前處理技術(shù)的不足。Kamankesh等[33]建立了電膜萃取與液液微萃取相結(jié)合的前處理方法，樣品經(jīng)電膜萃取后再經(jīng)液液微萃取，有機(jī)溶劑需求量極低，符合綠色檢測的要求。該法高效、快速，富集倍數(shù)高，最終提取回收率達(dá)到82%～99%。

電膜萃取作為一種微型化萃取方法，對于基質(zhì)復(fù)雜的樣品具有顯著的富集純化效果，同時(shí)裝置容易制備，所需樣品和溶劑的量都以μL計(jì)，是一種環(huán)境友好型的檢測方法。但目前仍受限于SLM的不穩(wěn)定性，萃取效率在一定范圍內(nèi)與電壓呈正相關(guān)，但SLM可能會(huì)在高電壓的情況受熱脫落，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。因此，對于不同目標(biāo)物質(zhì)，尋找適宜、穩(wěn)定的SLM至關(guān)重要。未來的電膜萃取趨勢也將是發(fā)展更穩(wěn)定的新型SLM，從而給樣品分析帶來更多新選擇。

圖1 電膜萃取過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of electromembrane extraction

3 結(jié)論與展望

前處理方法是生物胺檢測過程中不可或缺的過程，傳統(tǒng)液液萃取作為最常用的生物胺處理方法，存在有機(jī)溶劑消耗量大、易發(fā)生乳化現(xiàn)象等缺點(diǎn)，固相萃取可以避免乳化現(xiàn)象的發(fā)生，但萃取材料無法多次使用。電膜萃取可應(yīng)用于不同的基質(zhì)，并且解決了后續(xù)檢測技術(shù)不兼容的問題，但支撐液膜無法在高萃取電壓下保持良好的穩(wěn)定性，可能導(dǎo)致萃取溶劑流失，需要開發(fā)出耐熱性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的膜材料。未來樣品前處理方法發(fā)展趨勢將轉(zhuǎn)向綠色高效，主要發(fā)展發(fā)向可概括為以下幾點(diǎn)：①簡化步驟，盡可能減少甚至避免使用有機(jī)溶劑；②對目標(biāo)物質(zhì)具有較高的選擇性，可以在較短時(shí)間內(nèi)完成富集；③所用到材料易于制備、穩(wěn)定性強(qiáng)、成本低；④脫離實(shí)驗(yàn)室檢測環(huán)境，實(shí)現(xiàn)商品化，可廣泛應(yīng)用于日常生活的檢測。除以上發(fā)展趨勢外，多種前處理方法聯(lián)合應(yīng)用也將是未來分析方法發(fā)展的新趨勢，優(yōu)勢互補(bǔ)，可以得到更高的富集倍數(shù)，更低的檢測限。隨著食品分析領(lǐng)域的需求不斷提高，今后將會(huì)不斷涌現(xiàn)更多高效、快速、便捷的新型樣品前處理技術(shù)，為食品中生物胺的快速精準(zhǔn)測量提供重要的保障。