土壤多環(huán)芳烴污染生物表面活性劑強化修復的研究進展

姚丹丹，王輝，田坤，王寧，代威，程功弼，劉云

(1.中國科學院南京土壤研究所 土壤環(huán)境與污染修復重點實驗室，江蘇 南京 210008；2.中國科學院大學，北京 100049；3.江蘇蓋亞環(huán)境科技股份有限公司，江蘇 蘇州 215000)

隨著工業(yè)的快速發(fā)展，化石燃料的快速消耗和生物質(zhì)燃燒導致多環(huán)芳烴(PAHs)在水土等環(huán)境中積聚并且造成環(huán)境污染，嚴重威脅到生態(tài)安全及人類健康。由于生物修復技術(shù)具有良好的社會、生態(tài)綜合效益，在PAHs污染土壤修復中具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。然而，由于PAHs水溶性低，導致生物修復技術(shù)對土壤中PAHs降解效率不高，表面活性劑強化修復技術(shù)(SER)可提高PAHs生物利用度，從而提高PAHs污染土壤的修復效果。相較于化學表面活性劑，生物表面活性劑由于其優(yōu)良的表面活性和綠色低毒的優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用在SER中，逐步成為土壤修復領(lǐng)域的熱點。

本文總結(jié)了生物表面活性劑增強土壤PAHs微生物、植物以及微生物-植物聯(lián)合降解技術(shù)，介紹了生物表面活性劑的性質(zhì)和強化生物降解PAHs性能及降解機制；討論了生物因素和非生物因素對生物表面活性劑強化降解PAHs性能的影響，并指出SER目前存在的技術(shù)缺陷和研究熱點方向。

1 土壤多環(huán)芳烴污染現(xiàn)狀

世界人口的迅速增長及工業(yè)和人為活動的激增，致使環(huán)境中有毒污染物濃度呈指數(shù)上升[2]。PAHs是由兩個或兩個以上苯環(huán)結(jié)構(gòu)構(gòu)成的一類疏水性有機化合物，產(chǎn)生途徑大致分為4種：①石油(來源于燃料)；②熱解(來源于不完全燃燒)；③生物(通過有機代謝產(chǎn)生)；④成巖作用(通過轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)生)[2]。我國與亞洲其他國家PAHs污染水平相當，高于南美洲、大洋洲和非洲，低于北美洲[1]，但我國土壤受PAHs污染整體形勢依舊嚴峻，北方等重工業(yè)地區(qū)表層土壤中PAHs含量高于南方地區(qū)，城區(qū)表層土壤中PAHs含量高于農(nóng)村，且近年來呈現(xiàn)出由城市向農(nóng)村逐漸擴散的趨勢。由于PAHs具有高辛醇水分配系數(shù)易吸附在土壤顆粒上，使PAHs具有較低的生物有效性，不易被微生物降解，特別是高分子量多環(huán)芳烴(HMW PAHs)能夠長期在土壤環(huán)境中累積，給生態(tài)系統(tǒng)和人類健康造成了嚴重威脅。

2 生物修復多環(huán)芳烴污染土壤

生物修復技術(shù)是指利用生物(動、植物和微生物)代謝與富集能力實現(xiàn)污染物礦化的過程。

動物修復是指利用蚯蚓等清除污染土壤中的污染物。蚯蚓可以通過間隙水中的潮濕“體壁”“吸收”溶解PAHs，也可以在土壤通過腸道時通過嘴“攝入”經(jīng)由腸道降解[3]。蚯蚓還可以通過排泄容易降解的碳來刺激微生物的活性并促進其生長，從而實現(xiàn)PAHs的降解。土壤動物修復也有一些限制，如蚯蚓生存需要適宜的條件，且只對輕度污染的土壤有效，極端的溫度會使蚯蚓的存活率降低。

植物修復是基于植物多種過程進行的環(huán)境修復技術(shù)，包括植物積累、植物吸收、植物固定、根際降解等。Na等[4]通過盆栽試驗研究羊茅(火鳳凰)對污染土壤PAHs的降解能力，150 d后發(fā)現(xiàn)PAHs去除率為68.29%。此外，玉米對土壤中PAHs的去除也有較好效果，60 d的室內(nèi)盆栽試驗使土壤中10～100 mg/kg芘的降解率達81.19%～89.13%，并且提高了玉米根際土壤中脫氫酶和脲酶的活性[5]。但植物修復技術(shù)易受氣候及地質(zhì)條件等因素限制，對高濃度或深層PAHs污染土壤的修復效果不佳。

微生物修復是利用微生物將PAHs轉(zhuǎn)化為CO2、H2O或其它小分子化合物的過程[6]。細菌是土壤微生物中占比最大和最活躍的一類微生物，大多數(shù)通過自身固有的胞內(nèi)酶如加氧酶、二羥基酶等代謝PAHs。真菌則可同時利用胞外和胞內(nèi)的降解酶降解PAHs[7]，并且，當苯并[a]芘單獨或與鄰苯二甲酸、琥珀酸鈉等作為共代謝底物時，在降解菌分泌的木質(zhì)素降解酶等酶類作用下，苯環(huán)會斷開分解為琥珀酸、丙酮酸及乙醛等[8]。雖然微藻對PAHs的生物降解研究相對較少，但有研究發(fā)現(xiàn)當藻類與細菌聯(lián)合對PAHs的降解效果較為明顯[9]，這是由于藻類既可以通過光合作用提供O2給好氧細菌，有利于礦化PAHs并吸收釋放CO2，還可以協(xié)助共代謝降解、產(chǎn)生生物表面活性劑或其他代謝產(chǎn)物，提高細菌的活性和PAHs的生物利用度。綜上，生物修復通過自然過程將有害的PAHs轉(zhuǎn)化為毒性較低的化合物，解決了傳統(tǒng)修復方法的缺點。

3 生物表面活性劑強化生物修復

雖然大量的研究已證明生物修復能夠有效去除土壤中PAHs，然而，由于PAHs溶解度低，且容易吸附到土壤中，致使生物修復技術(shù)難以達到預期效果。為了解決上述限制，研究人員采用表面活性劑作為增溶劑，提高PAHs的生物可利用性。但是隨著研究的進一步深入，人們發(fā)現(xiàn)合成表面活性劑對生物具有較大毒性和抑制作用，這些毒副作用限制了合成表面活性劑在SER中的應(yīng)用。

3.1 生物表面活性劑的研究進展

3.1.1 生物表面活性劑的性質(zhì) 生物表面活性劑是由植物或微生物產(chǎn)生的具有兩親性的代謝產(chǎn)物，具有乳化、發(fā)泡和分散特性，被廣泛應(yīng)用于化妝品、石油、農(nóng)用化學品和化肥等多個領(lǐng)域[10]。與合成表面活性劑相比，生物表面活性劑在PAHs污染土壤的修復領(lǐng)域具有更大的潛力。首先，生物表面活性劑分子結(jié)構(gòu)復雜多樣，具有較高的表面活性和乳化特性。Shi等[11]利用銅綠假單胞菌制備的脂肽，可將PAHs乳化成微小顆粒，提高PAHs在水相中的生物利用度。其次，生物表面活性劑易降解和毒性低，毒性通常比合成表面活性劑低幾十甚至百倍[12]。鼠李糖脂在好氧時降解率達74%，而TritonX 100在好氧時只有輕微降解[13]。此外，生物表面活性劑還具有較寬的pH、溫度和鹽度適用范圍[14]。Shavandi等[14]證實，由紅球菌產(chǎn)生的胞外脂和糖脂在高鹽度(NaCl 10%)、高溫(120 ℃)、較寬的pH值范圍內(nèi)(2～12)仍然保持較高的活性和穩(wěn)定性。

臨界膠束濃度(cmc)和親水親脂平衡(HLB)是表征生物表面活性劑性質(zhì)的重要參數(shù)。在較低的濃度下，生物表面活性劑以單體的形式在空氣/水和油/水界面上排列有序，隨著濃度的增加疏水基團相互吸引開始聚集形成膠束[15]，此時表面活性劑濃度稱為cmc，且其增溶性、電導率、光散射強度等物理性質(zhì)也會發(fā)生變化[15](圖1)。HLB是衡量生物表面活性劑親水性或親脂性的指標。增溶效果隨HLB值增加而增加，HLB值較低說明生物表面活性劑是親脂性的，HLB值較高說明水溶性較好[15]。

圖1 生物表面活性劑濃度與表面張力、 界面張力和PAHs溶解度的關(guān)系[15]Fig.1 Relationship between biosurfactant concentration and surface tension，interfacial tension and solubility of PAHs

3.1.2 生物表面活性劑的來源與分類 生物表面活性劑的來源、類型及應(yīng)用見表1。

表1 常見的生物表面活性劑的來源、類型及應(yīng)用Table 1 Sources，types and applications of common biosurfactants

按照其結(jié)構(gòu)特征可分為糖脂、脂肽和脂蛋白、脂肪酸和磷脂、中性脂以及聚合物表面活性劑等；按照分子量分為低分子質(zhì)量(糖脂、磷脂)和高分子質(zhì)量(脂多糖、脂蛋白)。目前，應(yīng)用較為廣泛的是微生物源鼠李糖脂和槐糖脂。鼠李糖脂是國內(nèi)最早研究并成功產(chǎn)業(yè)化的生物表面活性劑，HLB值為22～24。槐糖脂是由假絲酵母菌以糖和植物油等為碳源，經(jīng)一定條件的發(fā)酵產(chǎn)生的微生物次級代謝產(chǎn)物[26]，主要有內(nèi)酯型和酸型兩種結(jié)構(gòu)類型。鼠李糖脂和槐糖脂性能相近，槐糖脂分子量較大，屬低泡型表面活性劑，更適用于工業(yè)和民用清洗、化妝品等領(lǐng)域。與微生物源表面活性劑相比，植物源表面活性劑更易于生產(chǎn)，可從500多種植物的根、莖和葉中提取[27]，其中被廣泛研究的一類為皂苷，皂苷的疏水基團由三萜或甾體骨架組成，親水性基團由幾個糖類殘基組成，然后通過糖苷鍵連接到疏水支架上，這種特殊的兩親結(jié)構(gòu)賦予了皂苷良好的乳化特性和更低的cmc值[27]，使其擁有更優(yōu)良的增溶洗脫特性。

3.2 生物表面活性劑強化微生物修復

PAHs降解功能細菌通常具有特殊的細胞結(jié)構(gòu)，含有更多的核糖體，PAHs可以在細胞質(zhì)膜上積累，并且合成磷脂的能力更強[28]。引入生物表面活性劑可以增加溶解態(tài)PAHs和微生物表面疏水性，從而強化PAHs生物降解。有一類細菌同時擁有代謝PAHs和分泌出生物表面活性劑的能力。Nie等[29]從污染場地土壤中分離到一株可產(chǎn)生10余種新型鼠李糖脂的PAHs降解菌，在1.5 h之內(nèi)就可降解多種PAHs。單個菌株通常難以達到較好的降解效果，構(gòu)建兩種或以上的微生物混合菌群也是近年來研究的熱點。Makkar等[30]構(gòu)建的人工菌群可以生產(chǎn)兩種新型脂肽，并可將PAHs完全降解。

真菌具有在廣泛生境和極端環(huán)境條件下存活的能力，因此被認為是一類PAHs潛在的降解菌[31]。白腐真菌能夠分泌木質(zhì)素過氧化物酶(Lip)、漆酶(Lac)和錳過氧化物酶(Mnp)等，可以高效快速地降解PAHs[31]。Lip、Lac和Mnp通過單電子攻擊形成自由激發(fā)態(tài)羥基，再氧化PAHs形成醌可直接開環(huán)而被礦化，隨后進入三羧酸循環(huán)(TCA)，最后礦化為CO2與H2O[31]。生物表面活性劑的存在對真菌的生長具有特異性的調(diào)節(jié)作用，可以提高真菌可溶性底物的生物利用度、刺激真菌孢子的生長和運輸。除了真菌的生長外，生物表面活性劑對分泌的木質(zhì)素分解酶和氧化酶的活性也有調(diào)節(jié)作用[32]。彩絨革蓋菌在PAHs和鼠李糖脂的存在下，可刺激多種酶(漆酶、芳醇氧化酶、錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶)的分泌，最終促進PAHs高效降解[32]。

3.3 生物表面活性劑強化植物修復

生物表面活性劑與植物聯(lián)用可以增加土壤中有機碳的含量、刺激微生物活性并增強植物根際污染物的降解，被越來越多地應(yīng)用在PAHs污染土壤修復中(表2)。Liao等[33]通過盆栽試驗證實了鼠李糖脂和Tween 80能夠促進玉米根系對PAHs的積累，植物的根系分泌物也可能與鼠李糖類相互作用增強PAHs的擴散作用。據(jù)報道，植物內(nèi)生菌能夠在PAHs污染場地中產(chǎn)生生物表面活性劑，促進植物在脅迫條件下的生長，提高土壤酶活性，降低PAHs的毒性作用[34]。另外，內(nèi)生菌比根際或土壤細菌具有更強的植物修復PAHs的能力[34]。適當?shù)闹参锖蛢?nèi)生菌組合能夠更好地促進植物的生長，植物為內(nèi)生菌提供了營養(yǎng)豐富的棲息地，從而使它們免受外界脅迫，促進植物體內(nèi)或根際PAHs的生物降解。

表2 PAHs土壤污染的生物表面活性劑強化植物修復實例Table 2 Examples of biosurfactant-enhanced phytoremediation of PAHs soil pollution

3.4 生物表面活性劑強化植物-微生物聯(lián)合修復

植物對PAHs的去除能力相對較差，而微生物在降解PAHs過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，因此在實際土壤污染中向植物根際接種高效降解菌株是一種提高PAHs去除效果的有效方法(圖2)，PAHs的增溶洗脫是前提，微生物降解或植物吸收積累是關(guān)鍵。植物根系除了為微生物在土壤中的定殖提供了微環(huán)境，還可以提供大量可溶性有機物和次生植物代謝物，從而強化降解根際區(qū)域的PAHs[41]。真菌和細菌在PAHs降解過程中起著協(xié)同和互補的作用，真菌能夠刺激HMW PAHs的初始降解反應(yīng)，細菌則主要對其代謝產(chǎn)物起作用[41]。具體的協(xié)同降解途徑是在P450單加氧酶的作用下，PAHs經(jīng)過真菌代謝生成反式二氫二醇，再經(jīng)脫氫酶催化進一步轉(zhuǎn)化為二醇產(chǎn)物[42]，最終在細菌分泌的酶催化下轉(zhuǎn)化為CO2和H2O。PAHs的消解過程中植物富集作用貢獻較小，Zheng等[43]利用烷基糖苷、三葉草與枯草芽孢桿菌組成的聯(lián)合體系計算了芘消解的貢獻率，三者協(xié)同作用的貢獻度為32.12%，植物富集的貢獻度極小(<0.3%)。

圖2 生物表面活性劑強化植物-微生物聯(lián)合修復PAHs污染土壤的過程Fig.2 The process of biosurfactant-enhanced plant-microbe symbiotic remediation in PAHs-contaminated soil

3.5 強化生物修復的影響因素

生物修復受污染物吸附/解吸過程、微生物活性、代謝產(chǎn)物等影響。因此生物表面活性劑強化生物修復的效果取決于以下幾個因素，包括植物和微生物特征等生物因素以及生物表面活性劑濃度、PAHs的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)、環(huán)境因素等非生物因素。

3.5.1 生物因素 不同的植物種類轉(zhuǎn)化和吸收PAHs的能力不同，禾本科牧草對PAHs的去除能力優(yōu)于草本植物[44]；植物對不同PAHs的去除和轉(zhuǎn)化存在差異，HMW PAHs具有很強的生物蓄積能力，在植物中的運輸能力較差，因此，易積累在植物的根系；不同植物根系分泌物對PAHs的去除能力也不同。微生物種類和組合對PAHs降解能力也存在差異[41]，不同的細菌與真菌組合會存在協(xié)同或抑制作用[41]。土著微生物、噬菌體和原生動物的存在也是至關(guān)重要的，它們與降解微生物競爭營養(yǎng)，可能成為降解微生物的掠奪者[41]。

3.5.2 非生物因素 生物表面活性劑濃度是非生物因素中常見的指標，低濃度(cmc)有時會通過在植物根際或微生物周圍形成保護層，從而削減真菌降解PAHs的有效性。而過高濃度往往還會影響PAHs降解酶的穩(wěn)定性，導致修復效率降低[45]。

PAHs自身的結(jié)構(gòu)、物理和化學性質(zhì)是非生物因素中另一重要指標。隨著PAHs環(huán)數(shù)增加其溶解度逐漸減低，因此，對于HMW PAHs需要更多的生物表面活性劑投加量。不同PAHs對植物和微生物的毒性作用也不同，植物對分子量較小的PAHs具有較好的降解能力，但對HMW PAHs降解能力較差。降解過程中PAHs組分間也可能相互作用，改變混合物生物降解的速率和程度。雖然多底物會提高PAHs的整體生物利用率，但各種PAHs間存在競爭抑制現(xiàn)象，當菲和芘共存時芘的降解會被抑制[46]。

環(huán)境因素對PAHs修復具有多方面影響。首先，水分直接影響土壤中的氧含量，這對細菌、真菌活性及植物生長發(fā)育至關(guān)重要。土壤表面過于致密，對好氧微生物的生存產(chǎn)生抑制作用，土壤顆粒與PAHs緊密地結(jié)合在一起，不利于植物的生長；其次，土壤質(zhì)量的差異也會影響PAHs的降解。研究表明，在土壤中添加N、P等養(yǎng)分能促進土壤中細菌和真菌的活性，特別是有助于低分子量多環(huán)芳烴(LWM PAHs)的氧化和分解，但對HMW PAHs的去除影響不大[47]。

3.6 強化生物修復機制

生物表面活性劑強化PAHs降解的主要機制有兩種：一種是動員作用，即促進PAHs的遷移，促使其與微生物細胞充分接觸。根據(jù)相似相溶性原則，生物表面活性劑單體的疏水基團傾向于附著在PAHs上，親水性基團更傾向于水相，單體在油水界面上的積累降低了界面張力。同時，疏水端吸附在PAHs表面，并沿兩者界面緩慢滲透擴散形成親水吸附層[48]，改變固體表面的潤濕性，在水力作用下PAHs被遷移至水相中，微生物會更快地獲得生長所需的底物。

另外一種主要機制是通過增溶作用，即通過生物表面活性劑乳化PAHs提高其溶解度，同時調(diào)節(jié)微生物細胞與PAHs間的相互作用，改變微生物表面性質(zhì)，最終影響PAHs的生物降解速率和降解過程。一般情況下，生物表面活性劑濃度只有超過cmc點形成膠束時才能起到增溶作用。根據(jù)分配原則，膠束的疏水中心也可以在PAHs或土壤上爭奪疏水污染物的分配，PAHs在水溶液中通過分配作用轉(zhuǎn)移到膠束中。因此，當PAHs分配到疏水中心時，它們的溶解度就會增加。Brown[49]將污染物的表觀水溶性解釋為水相(Caq)和膠束相(Cmic)中污染物的濃度之和，Edwards[50]進一步確定膠束相污染物濃度可以用一種線性分配關(guān)系來模擬：

Cmic=kmicSmicCaq

其中，kmic是PAHs-膠束的分配系數(shù)，S是膠束濃度，Smic是表面活性劑總濃度與其cmc的差值。

4 結(jié)語及展望

生物修復技術(shù)是目前PAHs污染土壤治理最具應(yīng)用和發(fā)展前景的綠色修復技術(shù)，但由于修復時間長、修復效率不高等缺點，限制了該技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。生物表面活性劑因具有可生物降解性、生態(tài)安全性和環(huán)境可接受性等特點，與生物修復技術(shù)聯(lián)合修復PAHs污染土壤引起研究者的興趣。然而，其高生產(chǎn)成本限制了其在生物修復過程中的應(yīng)用。因此，有必要尋找經(jīng)濟可行的大規(guī)模生產(chǎn)工藝。另外，生物表面活性劑可以通過與其他表面活性劑的復配方法降低修復成本，但需要考慮具體的實際污染狀況等多方面的因素。今后生物表面活性劑強化生物修復技術(shù)的研究還應(yīng)考慮以下幾個方面。

(1)目前生物表面活性劑強化生物修復機制還不深入。因此，結(jié)合盆栽試驗和實際污染土壤修復場地，可從微觀機理和宏觀現(xiàn)象等多角度揭示生物表面活性劑強化微生物或植物對PAHs降解規(guī)律、代謝機制以及在實際土壤基質(zhì)修復中應(yīng)用的可行性，并結(jié)合環(huán)境基因組學技術(shù)，從基因?qū)用娼沂旧锉砻婊钚詣?微生物-植物對PAHs的降解機制。

(2)過去PAHs污染土壤修復的研究主要依靠單一手段，今后應(yīng)結(jié)合不同的PAHs污染狀況、土壤類型、生物表面活性劑種類、微生物或植物等生物和非生物因素，設(shè)計一種最佳的生物表面活性劑-微生物-植物-目標土壤環(huán)境組合，以實現(xiàn)生物表面活性劑強化PAHs污染土壤的修復和大規(guī)模應(yīng)用。

(3)構(gòu)建PAHs污染土壤高效降解功能菌群，發(fā)揮功能微生物在PAHs污染修復中的高效降解作用。由于此類菌株源于受污染的環(huán)境基質(zhì)，對PAHs具有潛在的降解能力，使微生物的彈性、穩(wěn)定性、抗逆性和多功能等特性顯著增強。