苯酚-硫酸法測(cè)定保健酒中多糖含量的分析研究

朱 艷，李先芝，2，嚴(yán) 玲，毛瓊麗，石 豪，劉 洋，胡 楊，楊 峰，陳彥和

（1.勁牌有限公司，湖北大冶 435100；2.中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北大冶 435100）

隨著人類生活水平的提高，人們不斷加強(qiáng)健康理念的關(guān)注與需求。健康理念產(chǎn)品保健酒正逐步走進(jìn)人們的視野，其以白酒作為基酒，選擇有預(yù)防或滋補(bǔ)性能藥材或藥食同源物質(zhì)，應(yīng)用不同的手段使有效成分與酒體融合[1-2]。勁酒精選多味草本原料，采用數(shù)字提取技術(shù)，使內(nèi)容物溶解在酒中，該保健酒不但含有可水溶性的草木原料多糖，還含有其他保健功能因子，它們相互加強(qiáng)和補(bǔ)充，從而更大的發(fā)揮其保健功效，以達(dá)到抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)等保健功能[1-2]。作為重要的功能成分之一的多糖成分，對(duì)其含量的檢測(cè)是一項(xiàng)非常有意義的工作，用紫外分光光度法測(cè)定多糖含量，參考《中國(guó)藥典》[3]及相關(guān)文獻(xiàn)[4-8]中多糖檢測(cè)方法,針對(duì)該品種保健酒多糖的穩(wěn)定性、精密度等進(jìn)行優(yōu)化，以標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)值和回收率實(shí)驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)，得到好的試驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料及試劑：D-無(wú)水葡萄糖，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；保健酒，勁牌有限公司提供；重蒸苯酚，武漢科因斯生物科技有限公司。其他試劑均為分析純，所有水均為純水機(jī)所制一級(jí)水。

儀器設(shè)備：紫外分光光度計(jì)(型號(hào)TU-1901)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；離心機(jī)（型號(hào)3K15），德國(guó)西格瑪儀器公司；十萬(wàn)分之一電子天平（型號(hào)AB135-S），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；純水機(jī)（型號(hào)Option R7-Flex2），威立雅水處理技術(shù)（上海）有限公司；旋轉(zhuǎn)混勻器（型號(hào)WH-90A），上海振榮科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（型號(hào)XMTD-7000），北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取烘干至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，加純水溶解并稀釋到刻度，搖勻即得每毫升含葡萄糖約0.1 mg的對(duì)照品溶液。

1.2.2 樣品前處理

精密量取樣品適量，水浴蒸干，加5 mL 水溶解轉(zhuǎn)移至離心管中，精密加入20 mL 無(wú)水乙醇，混勻，冷藏過(guò)夜，8000 r/min離心10 min，棄去上清液，20 mL 80%乙醇水溶液離心洗滌2 次，殘?jiān)铀芙舛ㄈ葜吝m宜容量瓶中,作為供試品溶液。

1.2.3 比色液制備

分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL 及供試品溶液1.0 mL于比色管中，加入1.0 mL 5%苯酚溶液，混勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，混勻，沸水浴中煮沸15 min，冷卻至室溫，紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸收值。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)確定

根據(jù)1.2 中實(shí)驗(yàn)方法，在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上400～500 nm 范圍內(nèi)掃描吸收曲線。如圖1所示。

圖1 掃描圖

從標(biāo)準(zhǔn)溶液及供試品溶液掃描波長(zhǎng)可見(jiàn)，中國(guó)勁酒和葡萄糖溶液都在486 nm處有最大吸收峰。

2.2 供試品制備考察

2.2.1 不同取樣量實(shí)驗(yàn)比對(duì)

分別精密量取樣品5 mL、10 mL、15 mL、20 mL，水浴蒸干，分別加5 mL 水溶解轉(zhuǎn)移至離心管中，精密加入20 mL 無(wú)水乙醇，混勻，冷藏過(guò)夜，8000 r/min 離心10 min，棄去上清液，80%乙醇水溶液[1]離心洗滌2 次，殘?jiān)铀芙舛ㄈ葜?0 mL 容量瓶中,作為供試品溶液。測(cè)定相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

由表1 可看出，由于樣品含量較低，不同取樣量可能會(huì)造成樣品多糖含量檢測(cè)偏差，根據(jù)最佳吸光度范圍，選擇10 mL取樣量。

表1 不同取樣量相關(guān)數(shù)據(jù)

2.2.2 不同濃度醇沉實(shí)驗(yàn)比對(duì)

分別精密量取10 mL 樣品4 組，水浴蒸干，加5 mL、3 mL、2 mL、1 mL 水溶解轉(zhuǎn)移至離心管中，分別精密加入20 mL、17 mL、18 mL、19 mL 無(wú)水乙醇，混勻，冷藏過(guò)夜，8000 r/min 離心10 min，棄去上清液，用80 %、85 %、90 %、95 %乙醇水溶液離心洗滌2 次，殘?jiān)铀芙舛ㄈ葜?0 mL、100 mL、250 mL、250 mL 容量瓶中,作為供試品溶液。測(cè)定相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

從表2 可以看出，醇沉濃度越高，檢測(cè)出糖含量就越高，白酒本身含有大量的單糖，醇沉濃度越高，白酒中單糖造成測(cè)定結(jié)果偏高。通過(guò)文獻(xiàn)等資料查找，檢測(cè)多糖含量醇沉濃度選擇80 %乙醇水溶液最佳[4]。

表2 不同濃度醇沉相關(guān)數(shù)據(jù)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及線性考察

精密吸取每毫升含葡萄糖約0.1 mg 對(duì)照品溶液0.00 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL 置于10 mL 比色管中，補(bǔ)充水至1.0 mL，加入1.0 mL 5%苯酚溶液，混勻，加入濃硫酸5.0 mL，混勻，靜置5 min，沸水浴15 min，冷卻至室溫。用1 cm 比色皿以試劑空白溶液為參比，于486 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，繪制圖見(jiàn)圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線圖

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立相關(guān)數(shù)據(jù)

標(biāo)準(zhǔn)曲線：Abs=0.0752C-0.00514，R2=0.9998。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

勁酒按照以上樣品制備及顯色方法，連續(xù)分析6 次，得到各分析時(shí)的測(cè)得濃度，計(jì)算測(cè)得濃度精密度實(shí)驗(yàn)RSD 值為0.81%，表明儀器精密性良好，檢測(cè)結(jié)果的隨機(jī)誤差較小，見(jiàn)表4。

表4 精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及RSD值

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別取6 批次勁酒，按照以上樣品制備及顯色方法，得到各次分析時(shí)的測(cè)得濃度，計(jì)算測(cè)得濃度的RSD 值重復(fù)實(shí)驗(yàn)RSD 值為3.48 %，表明該方法重復(fù)性穩(wěn)定，檢測(cè)結(jié)果的隨機(jī)誤差較小，見(jiàn)表5。

表5 重復(fù)性數(shù)據(jù)及RSD值

2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取勁酒5.0 mL，精密稱取共12 份，分別加入濃度為1068 mg/L 的葡聚糖溶液0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL，每組3 個(gè)平行，按樣品重復(fù)性計(jì)算出中國(guó)勁酒含量為0.5269 mg，按照以上樣品制備及顯色方法，計(jì)算出添加葡聚糖的回收率，相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表6。

表6 5.0 mL取樣量加標(biāo)回收試驗(yàn)

3 結(jié)論

苯酚-硫酸法測(cè)定勁酒中多糖的方法穩(wěn)定，精密度高，線性范圍為0～0.1 mg/mL，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9998，平均回收率為96.64 %。在本研究試驗(yàn)條件下，取樣量與顯色有一定的關(guān)聯(lián)，選用保健酒最佳體積為10 mL；醇沉濃度對(duì)多糖沉淀有較大影響，通過(guò)實(shí)驗(yàn)比對(duì)及文獻(xiàn)參考，選擇最佳乙醇醇沉濃度為80 %[4-8]。勁酒采用多種草本原料進(jìn)行提取，酒體較為復(fù)雜，本研究為保健酒產(chǎn)品中多糖含量的檢測(cè)提供了技術(shù)參考。