國井綿雅醬香不同輪次堆積發酵的真菌群落多樣性研究

許 玲，于文娟，董喬娟，于盼盼，姜明慧，白秀彬，趙紀文

（山東扳倒井股份有限公司，山東高青 256300）

中國白酒釀造產區生態環境各異，微生態各不相同，進而導致白酒品種繁多、香型各異[1]。醬香型白酒作為中國白酒的傳統典型酒種之一，具有高溫制曲、高溫堆積、高溫發酵、高溫餾酒、長期貯存的“四高一長”工藝特點[2]。獨特的釀造工藝對質量風格有著至關重要的影響，微生物區系的形成及其生態功能的發揮又是關鍵所在。堆積發酵是醬香型白酒獨有的生產工藝，該過程的主要作用是網羅堆積場地和空氣中的微生物，生成多種酶類，在多種酶類的相互作用下合成酒體的前驅物質及香味物質[3-5]。

酵母菌和霉菌在醬香白酒釀造過程中發揮著巨大作用[2]，酵母是產乙醇和重要風味物質的關鍵微生物，霉菌能夠分泌多種酶類，對釀造原料降解和中國白酒風味的形成有重要貢獻[6]。

本研究應用Illumina Miseq 高通量測序技術，以醬香型白酒各輪次堆積酒醅為研究對象，針對不同輪次堆積酒醅的真菌菌群結構及多樣性進行對比研究，分析醬香型白酒酒醅堆積過程中真菌變化，探究各輪次高溫堆積階段的主要優勢菌群動態變化規律，為優化利用釀酒微生物資源和生產質量控制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

酒醅：取自山東扳倒井股份有限公司白酒釀造車間醬香型白酒堆積酒醅。

儀器設備：Illumina Miseq 2×300 bp 高通量測序平臺，生工生物工程上海股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣方法

樣品采自山東扳倒井股份有限公司7 個不同輪次醬香堆積發酵后的酒醅，每堆酒醅采樣按照升溫情況，在中軸斷面分為五個層次，每個層次分別取樣，取樣時在每個溫度層的所有位置均勻取樣，最后將五個層次的樣品混合，四分法取樣，即可代表本輪次堆積酒醅。每輪次樣品采集完后及時將樣品轉移至-80 ℃冰箱密封保存。

1.2.2 高通量測序分析方法

生工生物工程上海股份有限公司利用Illumina Miseq 2×300 bp 高通量測序平臺測序。將檢測后合格的基因組DNA稀釋作為模板。

真菌擴增區域為ITS1—ITS2；細菌PCR 擴增采用16S V3—V4 可變區的引物，古菌擴增V3—V4區，采用的是巢式PCR。擴增序列通過Illumina Miseq 2×300 bp 高通量測序平臺進行測序，下機數據經過cutadapt（去除接頭）、PEAR(序列對拼)、Prinseq (質量剪切），去除得分低于20 分、堿基模糊、引物錯配或測序長度小于150 bp的序列。

經過上述步驟，將標簽分組具有97 %序列相似性的高質量OTU 序列，真菌得到的OTU 代表序列比對RDP 數據庫和UNITE 數據庫；細菌和古菌得到的每個OTU 代表序列比對RDP 數據庫、silva數據庫和NCBI 16S 數據庫。最后通過人工進行檢查以獲得物種信息。

2 結果與分析

2.1 真菌菌群結構多樣性分析

2.1.1 基于可操作分類單元聚類分析

利用MiSeq 平臺的擴增子測序技術分析扳倒井醬香型白酒各輪次堆積酒醅真菌菌群結構多樣性及演替規律。應用稀釋曲線測序數據量可表征樣本中物種的豐富度、均一性或多樣性，并說明樣本的測序數據量是否合理[7]；Shannon 指數曲線可反映樣本微生物多樣性[8]。圖1 表明，本研究每個樣本的序列數均超過了22000，樣本的稀釋曲線與Shannon 指數曲線均趨于平坦，說明測序數據量足夠大，可以反映樣本中絕大多數微生物的多樣性信息。

圖1 樣品真菌的稀釋曲線和Shannon指數曲線

2.1.2 α-多樣性分析

α-多樣性分析可揭示堆積酒醅中微生物群落的豐富度和多樣性。計算Shannon 指數、Simpson指數、ACE 指數、Chao 指數和覆蓋率，以描述樣本中真菌菌群的多樣性[9]。

由表1 可知，不同輪次的堆積酒醅在97%水平下共得到真菌OTU 數為381，下沙輪次樣本中的OTU 數最高為147，五輪次為21，是全年樣本中OTU 數最低的。Shannon 指數、Simpson 指數、Chao指數和ACE 指數表明，下沙輪次堆積酒醅的真菌多樣性和豐富度明顯高于其他輪次，說明下沙輪次的堆積環境有利于真菌的繁殖；五輪次堆積酒醅的真菌多樣性和豐富度低于其他輪次，可見隨著一輪輪發酵酒醅環境越來越不適合真菌的繁殖。各個樣本的覆蓋率都在0.9990 以上，說明各樣品文庫的覆蓋率足夠大，絕大部分的微生物都被檢測到，測序結果充分體現了國井綿雅醬香白酒堆積酒醅真菌群落多樣性的真實情況。

表1 樣本真菌群落多樣性指數

2.2 堆積酒醅真菌群落組成分析

基于Illumina MiSeq 測序數據對國井醬香型白酒各輪次堆積酒醅中真菌的ITS1-ITS2 區序列進行分析，研究各輪次堆積酒醅真菌物種和群落結構，圖2 為各輪次堆積酒醅樣本在門水平上的真菌群落結構組成。

圖2 不同輪次堆積酒醅真菌群落結構（門水平）

從圖2 可知，堆積酒醅采集的樣品中共檢出4個門類。Ascomycota（子囊菌門）為第一優勢菌門，各輪次占菌群相對豐度的90 %以上，在五輪次時達到最大值，占菌群相對豐度的99.99%。Basidiomycota（擔子菌門）為第二優勢菌門，幾乎只存在于下沙階段，說明這些Basidiomycota（擔子菌門）可能主要來自于該輪次用的大曲、原輔料或者當時環境中。以上結果與已報道的醬香型白酒堆積酒醅及大曲微生物在門類結構上的研究具有相似性，孫利林[10]對醬香型白酒第四輪次酒釀造堆積酒醅研究時，發現最主要的是Ascomycota（子囊菌門）；李申奧[11]對兼香型白酒高溫大曲微生物研究時，發現Ascomycota（子囊菌門）為優勢菌門；Hu[12]研究白云邊酒高溫大曲微生物發現，真菌主要為Ascomycota（子囊菌門）、Unclassfied Fungi，其中Ascomycota（子囊菌門）為優勢菌門。

從圖3 可知，扳倒井醬香型白酒堆積酒醅樣品中共檢出25 個真菌菌屬。其中Issatchenkia（伊薩酵母屬）、Thermomyces（嗜熱真菌屬）、Aspergillus（曲霉屬）和Pichia（畢赤酵母屬）各輪次都可檢出且為優勢菌屬。Issatchenkia（伊薩酵母屬）在各輪次中均占50 %以上，五輪次占比高達96 %；Dipodascus（雙足囊菌屬）僅在下沙和糙沙輪次檢出，占比分別為19.59 %和0.13 %；Thermomyces（嗜熱真菌屬）在一輪次和二輪次占比較大，分別為12.88%和17.56 %；Pichia（畢赤酵母屬）在二輪次占比較大，為19.03%；Zygosaccharomyces（接合酵母屬）僅存在于四輪次，占比為2.38%。

圖3 不同輪次堆積酒醅真菌群落結構（屬水平）

Issatchenkia（伊薩酵母屬）產乙酸乙酯能力強,具有耐高溫、耐酒精度等特性；Thermomyces（嗜熱真菌屬）大多能產生具有高活力和熱穩定性的纖維素酶、蛋白酶等，對降解高分子多糖和蛋白質具有促進作用，有利于釀酒原料被微生物利用，起到促進微生物生長繁殖以及產酒生香的作用；曲霉屬（Aspergillus）可利用醬香型白酒偏酸性的釀造環境分泌酸性水解酶類，如酸性淀粉酶、酸性蛋白酶等，分解原料中的淀粉與蛋白質，為發酵提供持續性的動力[13]；蔡雪梅等[14]的研究發現一株Pichia kudriavzevii（庫德里阿茲氏畢赤酵母）可以產生多達64 種揮發性風味化合物，可作為白酒生香酵母。

3 結論

本研究使用高通量測序技術對堆積酒醅樣品中的微生物進行了分析研究。結果表明，各輪次堆積酒醅共檢出4 個真菌門類，Ascomycota（子囊菌門）為第一優勢菌門；共檢出25 個真菌菌屬，Issatchenkia（伊薩酵母屬）、Thermomyces（嗜熱真菌屬）、Aspergillus（曲霉屬）和Pichia（畢赤酵母屬）在各輪次都可檢出且為優勢菌屬。對比各輪次的檢測結果，下沙輪次堆積酒醅的真菌多樣性和豐富度最好，五輪次堆積酒醅的真菌多樣性和豐富度最差。