肩關節軸向拔伸法對兔肩周炎模型炎癥因子表達的影響*

周 進，范 蕓，段必雙，李盈盈，李英菁，涂添添，喻 俊

(1.云南中醫藥大學第一附屬醫院，云南 昆明 650021；2.云南中醫藥大學針灸推拿康復學院，云南 昆明 650504)

肩周炎是臨床常見病多發病，好發于50歲左右的女性，主要病因為勞損、受風寒濕邪侵襲、制動等導致肩關節周圍的肌肉、韌帶、滑膜等軟組織出現慢性炎癥，進而局部軟組織黏連，臨床多表現為肩部疼痛，夜間痛甚，肩部活動功能漸進性受限。肩周炎在治療時因為局部組織黏連會導致療程長、效果差，手法剝離黏連時，患者疼痛加劇，難以忍受，心理負擔較重，這些問題都是肩周炎治療過程中面臨的困難[1]。通過臨床觀察，肩關節軸向拔伸法對黏連期肩周炎有明顯療效，它可以減輕局部疼痛，松解局部黏連，使肩部活動功能得以改善[2]，該手法臨床效果明顯，但一直缺乏基礎實驗研究。本實驗通過肩關節軸向拔伸法干預兔肩周炎模型耳緣靜脈血清TNF-α、IL-6及患肩滑膜及肌肉組織中PGE-2、TGF-β1的表達，探討肩關節軸向拔伸法治療肩周炎的療效機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與動物分組 選體重在1.6～2.3 kg成年實驗家兔，共40只，由昆明市實驗動物中心(艾尼莫公司)提供，由云南中醫藥大學動物室喂養，室溫18℃～24℃，濕度35%～55%，實驗環境保持干凈衛生。先進行適應性喂養，1周以后隨機分成4組，每組10只：空白組、模型組、對照組及實驗組。整個實驗過程均按照科技部〔2006〕398號文件執行[3]，嚴格實施，以動物倫理學規定善待動物，對其處置均符合要求。

1.2 主要儀器設備 廠家及名稱：安徽中科中佳公司提供低溫高速離心機，型號：SC-3610；中科美菱公司提供低溫冰箱(-80℃)；美國eppendorf公司提供微量加樣器(10μl)、多通道移液器(300ul)；美國伯樂公司提供全自動酶標儀，型號：Model 550；美國Millipore公司提供Milli-Q純水器；常熟市學科電器有限公司提供制冰機；北京優晟聯合科技有限公司提供旋渦混合器；江蘇太倉市實驗設備廠提供ZD-9556水平搖床。

1.3 主要試劑 廠家及名稱：北京晶美生物工程公司提供TNF-α、IL-6酶免試劑盒；北京綠源伯德生物公司提供PGE-2酶免試劑盒；武漢賽培生物公司提供TGF-β1酶免試劑盒；昆明制藥廠提供碘伏消毒劑、75%乙醇、0.9%氯化鈉注射液；北京化學試劑廠提供水合氯醛。

1.4 模型兔制作 采用模擬風寒濕邪環境加持續勞損法[4]制作兔肩周炎模型。以家兔右肩峰端為中心，在直徑約7 cm的面積用Na2S脫毛。先將家兔仰臥在操作臺上，然后固定左前肢和雙后肢，松緊適度，右前肢遠端和電動振蕩器固定，使肩關節搖動，其余關節可以固定，盡量不要搖動，270次/min的頻率，1.5 cm的振幅，連續3 d，每天至少8 h不間斷。專人固定查看搖動情況，注意右前肢不要松動和脫落。然后將家兔右前肢固定在兔籠上，用冷凍后的小號藍冰袋外敷家兔右肩部，及時更換融化后的藍冰袋，連續3 d，每天至少外敷8 h。調電吹風為冷風模式，在搖動和冰敷期間，持續吹家兔右肩。3 d后觀察家兔情況，發現其右前肢外翻，活動功能受限，爬行朝右側偏斜，表明家兔右肩有疼痛反應。通過肉眼觀察家兔右肩軟組織腫脹，局部有充血或瘀斑，提示造模成功[5]。造模后正常喂養3 d開始實驗干預。

1.5 干預方法 空白組常規飼養，不造模不予手法治療；模型組常規飼養，造模但不予手法治療；對照組采用推拿常規手法治療，每日上午10∶00～12∶00時由推拿專業研究生專人固定操作，每次干預時間為20 min；實驗組予肩關節軸向拔伸手法，也是每日上午10～12時由推拿專業研究生專人固定操作，每次干預時間為20 min；對照組和模型組均連續手法治療20 d。

1.5.1 常規推拿手法[6]將模型兔仰臥在操作臺上，左前肢及雙后肢固定，用按揉法及彈撥法在右前肢肩部施術，松解肩部緊張的肌肉、肌腱等軟組織，以及肩胛骨周圍；再彈撥肩前后緊張的肌筋膜，共8 min。接著，點壓肩周穴位，如肩井、肩髃、肩貞等，在黏連處施彈撥法，共5 min。然后，一手扶住家兔右前肢肩部，另一手扶肘部，由小到大的幅度環轉搖動肩部，共5 min。最后再內收、外展、后伸右前肢，內外旋轉肩關節，共2 min，結束治療。

1.5.2 肩關節軸向拔伸手法 將模型兔仰臥在操作臺上，左前肢及雙后肢固定，用按揉法及彈撥法在右前肢肩部施術，松解肩部緊張的肌肉、肌腱等軟組織，以及肩胛骨周圍；再彈撥肩前后緊張的肌筋膜，共5 min。接著，點壓肩周穴位，如肩井、肩髃、肩貞等，在黏連處施彈撥法，共4 min。充分放松肩部軟組織，再用肩關節軸向拔伸法治療，步驟為：(1)外展患肢，外展狀態下進行拔伸，持續用力，力量由輕到重，再由重到輕，在拔伸的同時進行內外旋轉肩關節。(2)上舉患肢，上舉狀態下進行拔伸，持續用力，輕重交替，在拔伸同時進行內外旋轉肩關節。(3)后伸患肢，后伸狀態下進行拔伸，持續用力，內外旋轉肩關節。上述手法反復施術，直到黏連之患肩有所松動，共10 min。最后，在患肩周圍按揉，手法輕柔滲透，來回搓動患側肩部及上肢，共1 min，結束治療。

1.6 標本采集 所有動物于實驗結束后1 d取材。首先在各組模型兔的耳緣靜脈取血各5 mL，以備檢測血清TNF-α、IL-6的含量；然后以10%水合氯醛、2 mL/kg體重比例，注射入耳緣靜脈，待麻醉完全后快速取材，在肱二頭肌、岡上肌、岡下肌、滑膜囊等部位取大小相同的組織塊放置在平整的冰面上，用0.9NS%漂洗表面血水，干凈后放入離心管，送至實驗室以-5℃低溫保存待測。最后以注射空氣法，在耳緣靜脈注入10 mL左右空氣，處死家兔。在實驗過程中因腸道感染死亡8只兔，分別為空白組1只、模型組2只，對照組2只，實驗組3只。

1.7 指標檢測 備好無抗凝劑的真空采血管，將各組抽取的耳緣靜脈血(5 mL)置于采血管中，室溫下自然凝固約15 min，在4℃條件下以每分鐘3000轉離心20 min，再分離血清，取上清液，貯存在零下70℃冰箱里待測。備好勻漿介質(成分：ph7.4、0.01 mol/L Tris-HC1、0.0001 mol/L EDTA 0.01 mol/L蔗糖、PMSF 0.1 mmol/L、BSA 0.1%)，將取好的組織塊放入冰水中，按10%比例放入勻漿介質，用手術剪剪碎組織塊，超聲勻漿30 s，在4℃條件下以每分鐘3000轉離心20 min，取上清液，存放在零下70℃冰箱中待測。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)，嚴格按試劑盒操作步驟檢測TNF-α、IL-6、PGE-2、TGF-β1。

2 結果

2.1 4組局部組織肉眼觀察結果 空白組從外觀上觀察，局部形態正常，皮膚顏色透亮，肌腱組織收縮有彈性；肌肉組織飽滿、收縮有韌性、顏色紅潤；滑膜組織薄亮，收縮有緊致感。模型組肩部形態腫脹，可見肌腱組織充血腫脹，彈性差；肌肉組織色深紅或瘀斑，收縮韌性差，關節腔中有少量淡黃色液體滲出；滑膜組織稍厚，顏色較暗，收縮乏力。對照組的肌腱組織顏色白亮，收縮時柔韌性稍好；肌肉組織色暗，光澤度較差，關節腔中有少量微黃色液體滲出；滑膜組織較薄。實驗組肩部肌腱組織光亮，柔韌性好；肌肉組織色鮮紅，收縮彈性好，關節腔滑液顏色清澈；滑膜組織外觀薄亮，收縮有緊致感。

2.2 4組實驗兔肩關節腫脹程度比較 4組兔干預前后肩關節周長變化為：對造模后的三組家兔肩關節周長進行測量，發現均顯著增大(P<0.01)；干預后，測量對照組及實驗組肩關節周長，發現均顯著減小(P<0.01)；測量干預后實驗組肩關節周長，發現較對照組顯著減小(P<0.01)，見表1。

表1 各組兔干預前后肩關節周長比較

2.3 4組實驗兔血清TNF-α、IL-6水平比較 模型組與空白組比較，血清TNF-α、IL-6表達均顯著增加(P<0.01)；對照組與模型組比較，血清TNF-α、IL-6表達均顯著降低(P<0.05)；實驗組與模型組比較，血清TNF-α、IL-6表達均顯著降低(P<0.01)；實驗組與對照組比較，血清TNF-α、IL-6表達均顯著降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組兔血清TNF-α、IL-6水平變化比較

2.4 4組兔肱二頭肌、岡上肌、岡下肌、滑膜囊中PGE-2含量比較 空白組實驗兔肱二頭肌、岡上肌、岡下肌、滑膜囊中PGE-2有少量表達，模型組中PCE-2含量較空白組顯著升高(P<0.01)；對照組中PCE-2含量較模型組下降明顯(P<0.05)；實驗組中PCE-2含量較模型組顯著下降(P<0.01)；實驗組中PCE-2含量較對照組顯著下降(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組兔肱二頭肌、岡上肌、岡下肌、滑膜囊中PGE-2含量變化比較

2.5 四組兔肱二頭肌、岡上肌、岡下肌、滑膜囊中TGF-β1含量比較 空白組實驗兔肱二頭肌、岡上肌、岡下肌、滑膜囊中TGF-β1有少量表達，模型組中TGF-β1含量較空白組顯著升高(P<0.01)；對照組中肱二頭肌、岡上肌、滑膜囊中TGF-β1含量較模型組下降明顯(P<0.01)；實驗組中TGF-β1含量較模型組顯著下降，具有顯著統計學意義(P<0.01)；實驗組肱二頭肌、岡下肌中TGF-β1含量較對照組顯著下降(P<0.01)。詳見表4。

表4 各組兔肱二頭肌、岡上肌、岡下肌、滑膜囊中TGF-β1含量變化比較

3 討論

迄今為止，許多學者對肩周炎進行了大量研究，但其病因病理仍不清楚，因此有很多病因病理學說存在。有研究發現，肩周炎的發生和許多因素都有相關性，如糖代謝異常、甲狀腺疾病、器質性心臟病等[7]。糖尿病的病理過程可以導致繼發性肩周炎[8]，病理改變主要是引起細小血管硬化、內分泌失調等，從而導致肌肉肌腱等軟組織病變，這些病理變化可以加重肩關節纖維化，引起許多炎癥因子釋放，進一步導致肩部關節滑膜和韌帶復合體的炎性反應和纖維變性[9-10]。王正和等[11]臨床研究表明，患者不斷受到風寒侵襲，肩部的血液循環受阻和代謝異常，肩關節及其周圍會出現無菌性炎性反應和黏連，最終導致肩部疼痛、活動受限。王緒輝[12]通過動物實驗，觀察到模型兔肩部細小血管充血，炎癥反應強烈，包括局部組織缺血、炎細胞浸潤、變性等病理變化，這都和人類肩周炎病理過程類似。

近年來許多學者對肩周炎的發病機制進行了臨床及基礎研究。褚立希等[13]發現肩周炎患者肩部毛細血管擴張，炎性反應較重，組織液滲出導致水腫和壞死，影響了局部代謝，引起痛性物質釋放導致疼痛。Neviaser[14]通過手術活檢患者的攣縮關節囊，發現關節囊炎變。

Deplma通過手術發現患者肩部也有炎癥反應，這和關節周圍肌腱不斷滑動有關。Ogilvie[15]在關節鏡檢查中觀察到患者肩部關節囊周圍有纖維化和滑膜炎。Omari[16]認為，肩周炎的產生主要是滑膜炎以及各種炎性細胞、膠原及纖維細胞異常增殖，導致關節囊攣縮。Bunker等[17]對手術采集的標本進行組織學和免疫學研究發現，肩周炎的本質是纖維增生。

根據國內外學者的大量研究，認為炎癥反應和局部組織纖維化是肩周炎的病理基礎。一些學者的研究結果表明，肩周炎局部炎癥反應和修復過程都是大量炎性細胞因子參與的結果[18]。炎性細胞因子主要包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)和前列腺素E-2(PGE-2)。TNF-α是一種多肽細胞因子，它是由單核-巨噬細胞產生的。作為重要介質參與多種生理反應和免疫反應，和一些細胞因子維持內環境穩定，也介導感染、創傷等病理過程。商得俊[19]發現，TNF-α在肩周炎患者的血清中明顯升高，從而釋放出大量的炎癥介質，同時誘導其他細胞因子(如IL-1、IL-6，IL-8)產生，加重炎癥反應，參與疼痛的發生、發展和結局。IL-6是多效細胞因子之一，可把炎癥細胞聚集在一起，激活和釋放炎癥介質，不斷加速炎癥過程。PCE-2是一種由巨噬細胞合成和釋放的重要炎性致痛物質，它可參與一系列炎癥和免疫病理生理過程。我們已知過度勞損會導致肩周炎。在勞損應變過程中，肩部組織的氧化代謝增強，細胞膜通透性增加，線粒體膨脹，溶酶體釋放大量炎癥性致痛物質，如PGE-2、5-羥色胺、緩激肽等，引起肩部周圍軟組織的無菌性炎癥和疼痛[20]。肩周炎局部組織纖維化的過程主要與轉化生長因子β1(TGF-β1)有關。TGF-β1是一種有巨大生物學活性的，促進傷口愈合的細胞因子，它在纖維化和瘢痕形成過程中起到關鍵作用[21-22]。Rodeo SA等[23]研究顯示，原發性肩周炎和繼發性肩周炎患者肩關節囊中TGF-β1及其受體的表達明顯升高。李宏云等[24]也發現肩周炎患者肩袖間隙組織中TGF-β mRNA的表達水平明顯升高，這說明TGF-β1對肩周炎的發生發展中起重要作用。因此，肩周炎的病理過程離不開炎癥因子和炎癥引起的纖維化，這種無菌性炎癥會導致疼痛和組織黏連，從而導致肩關節功能障礙[25]。

肩關節軸向拔伸法遵循肩關節解剖結構學原理，對于不同的黏連病理采用相應的體位和松解步驟，具有明確的解剖學基礎，軸向手法松解力可直達病灶局部，通過對病灶的松解剝離，解除病灶局部組織的黏連，起到“松、動、通”的作用，從而緩解疼痛，達到恢復肌肉組織正常解剖學結構和功能的目的。通過和傳統推拿手法治療對比，肩關節軸向拔伸法治療肩部病變的軟組織更為直接和具有針對性，其粘連組織得到有效松解，炎癥得到消除，腫脹明顯減小，從而恢復肩關節局部正常組織形態。

本實驗結果顯示，造模后兔肩周炎模型TNF-α、IL-6、PGE-2、TGF-β1表達明顯升高，說明局部炎癥反應強烈，符合肩周炎病理過程。肩關節軸向拔伸法可顯著改善肩周炎模型兔滑膜及肌肉組織病理學改變，降低PGE-2、TGF-β1表達水平，也可以下調血清TNF-α、IL-6表達水平，因此可以推測，肩關節軸向拔伸法的作用機制為改善肩周炎病變局部組織病理變化，促進組織修復，減少肩關節滑膜及肌肉組織中炎癥因子PGE-2、TGF-β1的釋放，減輕肩周炎局部組織炎癥反應；還可以調節全身免疫，降低血清TNF-α、IL-6水平，通過整體和局部抗炎鎮痛對肩周炎起到治療作用。而且降低炎癥因子方面優于傳統推拿手法，差異具有統計學意義。綜上，肩關節軸向拔伸法能有效改善肩周炎導致的全身和局部癥狀，而且可以抑制炎癥因子的表達和改善局部病理組織形態。