昆明地區(qū)低病毒載量慢性乙肝患者血清高敏HBV DNA 檢測(cè)分析

普 冬，余婷婷，李麗華，張潤(rùn)武，武昆利，李冬玲

（昆明市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科/云南省傳染性疾病臨床醫(yī)學(xué)中心，云南 昆明 650041）

一直以來，我國人群中因感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）導(dǎo)致的慢性乙肝（chronic hepatitis B，CHB）、肝癌和肝硬化的患者具有較高的比率，已成為嚴(yán)重影響人民健康的公共衛(wèi)生問題[1]。近年來，各國相繼發(fā)布了多版的CHB 防治指南，均推薦采用高敏乙肝病毒載量檢測(cè)結(jié)果來判斷臨床治療終點(diǎn)，該方法檢測(cè)下限為10～12 IU/mL[2-4]。我國2019 版指南[1]也強(qiáng)調(diào)采用敏感的檢測(cè)方法進(jìn)行HBV DNA 檢查，而國內(nèi)常規(guī)的方法最低檢測(cè)限幾乎都是 200～1 000 IU/mL，很難滿足臨床診斷的需求。高敏 HBV DNA 檢測(cè)因其高靈敏度、特異性強(qiáng)且具有線性范圍寬、攜帶污染低等優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)HBV 感染進(jìn)行精準(zhǔn)的檢測(cè)，為臨床診治提供有力幫助。同樣，乙肝耐藥基因測(cè)序的原理是通過檢測(cè)其易突變區(qū)域的完整基因序列存在的具體突變情況，進(jìn)一步進(jìn)行序列比對(duì)分析判斷病毒核酸堿基是否突變，是專業(yè)公認(rèn)最直接、可靠的金標(biāo)準(zhǔn)方法。本研究利用檢測(cè)下限為 20 IU/mL 的高敏 HBV DNA 檢測(cè)技術(shù)，Sanger測(cè)序等技術(shù)，對(duì)昆明地區(qū)707 例持續(xù)低病毒載量水平的慢乙肝患者，進(jìn)行高敏病毒載量、HBV 的基因型以及耐藥突變位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，進(jìn)一步探討HBV 低水平病毒血癥患者病毒載量水平、HBV 的基因型分布特點(diǎn)、HBV P 區(qū)耐藥突變位點(diǎn)的特征，同時(shí)結(jié)合HBeAg、HBsAg 及ALT 水平等分析其與高敏 HBV DNA 的關(guān)聯(lián)性，期望為臨床提供治療慢乙肝患者的參考依據(jù)，制定出更個(gè)體化的、有效的、精準(zhǔn)的治療方案。

1 資料與方法

1.1 病例資料

采集2021 年1 月至2021 年12 月期間于昆明市第三人民醫(yī)院就診的707 例持續(xù)低水平HBV DNA 的慢乙肝患者血清標(biāo)本，男449 例，女258 例，年齡19～73 歲，平均55.5 歲。所有患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)，均符合我國頒布的2019 版《慢性乙型肝炎防治指南》[1]。

1.2 主要儀器和試劑

高敏HBV-DNA 采用羅氏COBASAmpliPrep/COBAS TaqMan48 病毒載量系統(tǒng)，試劑盒購自羅氏診斷公司；乙型肝炎病毒分型和耐藥測(cè)序采用美國ABI 公司生產(chǎn)的 3500Dx 測(cè)序儀，試劑盒購買自廣州立菲達(dá)安公司；血清HBsAg 測(cè)定，采用的是羅氏診斷公司生產(chǎn)的Modular E610 全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，試劑購買自羅氏診斷公司；血清ALT 定量測(cè)定采用日本奧林巴斯生產(chǎn)的AU5400 型生化分析儀，試劑購自日本和光純藥株式會(huì)社。

1.3 高敏HBV DNA 定量檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行乙肝病毒載量檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度為20 IU/mL。

1.4 乙肝病毒的分型以及耐藥基因位點(diǎn)的檢測(cè)

從血清標(biāo)本中提取乙肝病毒核酸，對(duì)HBV P區(qū) RT 段序列進(jìn)行擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物純化后，利用基因測(cè)序儀進(jìn)行Sanger 測(cè)序。通過對(duì)乙肝病毒的基因型以及核苷類藥物耐藥相關(guān)位點(diǎn)（如：rt184、rt204、rt169、rt180、rt181、rt173、rt236、rt250 等）進(jìn)行基因序列比對(duì)分析，并且參照《2017 年歐洲肝病年會(huì)乙型肝炎病毒感染臨床實(shí)踐指南要點(diǎn)》[5]，進(jìn)行不同藥物的耐藥位點(diǎn)檢出情況及分類的結(jié)果判讀。

1.5 血清HBeAg、HBsAg 測(cè)定

采用羅氏Modular E610 全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對(duì)血清HBeAg、HBsAg 進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果：S/CO≥1.0 為陽性。

1.6 血清ALT 定量測(cè)定

采用奧林巴斯AU5400 型生化分析儀對(duì)血清ALT 進(jìn)行檢測(cè)，正常參考范圍：上限為40 U/L。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。資料組間分類計(jì)數(shù)比較，采用χ2檢驗(yàn)，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 707 例持續(xù)低載量的慢性乙肝患者相關(guān)病毒學(xué)特征和基因型分布

707 例持續(xù)低載量慢性乙肝患者中，高敏HBV DNA ＜ 500 IU/mL 446 例，占（63.50%），＜ 2 000 IU/mL 的慢性乙肝患者共有576 例，占（81.90%）；HBeAg 陽性262 例（37.05%），基因分型以C 基因型占比最高60.53%（428/707），見表1。

表1 低病毒載量的慢性乙肝患者病毒學(xué)特征和基因型分布Tab.1 Virological characteristics and genotype distribution of chronic hepatitis B patients with low viral load

2.2 196 例HBeAg 陽性且HBV DNA ＜ 2 000 IU/mL 慢性乙肝患者的基本特征

本研究707 病例中，高 敏HBV DNA ＜2 000 IU/mL 的慢性乙肝患者共有576 例，其中HBeAg 陽性者196 例。在196 例HBeAg 陽性且HBV DNA ＜ 2 000 IU/mL 慢性乙肝患者組中，男性為主，占69.89%；ALT ＞ 40 U/L 占28.57%，有73.47%的患者HBV DNA ＞ 20 IU/mL，HBsAg 定量為100～999、1 000～9 999 IU/mL 的患者占比分別為25.51%和51.53%，見表2。

表2 196 例HBeAg 陽性且HBV DNA ＜ 2 000 IU/mL 慢性乙肝患者的基本特征Tab.2 Basic characteristics of 196 chronic hepatitis B patients with HBeAg（+）and HBV DNA ＜ 2 000 IU/mL

2.3 707 例持續(xù)低載量的的慢性乙肝患者臨床指標(biāo)比較

持續(xù)低載量的慢乙肝患者臨床指標(biāo)比較，HBeAg 陽性率、ALT 異常率、耐藥位點(diǎn)和其它位點(diǎn)突變率在不相同HBV DNA 水平之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），在265 例HBV DNA ＜ 20 IU/mL 的慢性乙肝患者中，HBeAg 陰性者占80.38%（213 例），HBeAg 陽性占19.62%（52 例）。其中，在265 例HBV DNA ＜ 20 IU/mL 慢性乙肝患者中，ALT ＞ 40 U/L 占18.49%，具體如表3 所示。在53 例HBV DNA 20～99 IU/mL 和128 例HBV DNA 100～499 IU/mL 慢性乙肝患者中，耐藥位點(diǎn)和其它位點(diǎn)突變率較高。

表3 不同HBV DNA 低載量慢性乙肝患者臨床指標(biāo)比較[n（%）]Tab.3 Comparison of clinical indicators in patients with chronic hepatitis B with different HBV DNA load [n（%）]

2.4 高敏 HBV DNA ＜ 500 IU/mL 患者在不同耐藥突變情況下HBV DNA 水平與HBeAg、ALT 異常率分析

本研究707 病例中，高敏HBV DNA ＜ 500 IU/mL的慢性乙肝患者共有446 例，占63.08%，將其分為耐藥突變組、無耐藥突變組和其它位點(diǎn)突變組。HBeAg 陽性率、ALT 異常率在不相同HBV DNA水平之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），而在耐藥突變組中ALT 異常率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 446 例高敏 HBV DNA ＜ 500 IU/mL 患者在不同耐藥突變情況下HBV DNA 水平與HBeAg、ALT 異常率分析[n（%）]Tab.4 Analysis of HBV DNA level and abnormal rate of HBeAg and ALT in 446 patients with highly sensitive HBV DNA ＜500 IU/mL under different drug-resistant mutations [n（%）]

3 討論

定量檢測(cè)HBV DNA，能準(zhǔn)確地反映慢性乙肝患者體內(nèi)乙肝病毒的復(fù)制水平，在治療效果監(jiān)測(cè)、制定療程、判斷治療終點(diǎn)等方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值[6]。同時(shí)也可判斷乙肝病毒復(fù)制程度、為進(jìn)行HBV 基因分型及耐藥檢測(cè)提供相關(guān)信息[7-8]。近年來，國內(nèi)外的乙肝防治指南都推薦使用高敏檢測(cè)方法檢測(cè)HBV DNA，以幫助判斷治療終點(diǎn)。比如我國最新的《慢性乙型肝炎防治指南》（2019 版）[1]明確的指出：CHB 的治療的目標(biāo)是長(zhǎng)期地、最大限度地抑制 HBV 復(fù)制，如果部分患者已經(jīng)具備了臨床治愈的適合條件，應(yīng)力求其達(dá)到停止治療以后仍然保持HBsAg 為陰性、檢測(cè)不到HBV DNA、肝臟相關(guān)生物化學(xué)指標(biāo)正常的治療目標(biāo)。而目前我們國內(nèi)常規(guī)HBV DNA 熒光定量檢測(cè)下限普遍 ＞ 100 IU/mL，陰性范圍寬、靈敏度低[9]，難以完全滿足臨床治療的需求。本研究中707 例持續(xù)低載量慢性乙肝患者中，高敏HBV DNA ＜ 500 IU/mL 446 例，占（63.50%），如果檢測(cè)方法不夠敏感，這類患者很可能被臨床忽視，不能被及時(shí)發(fā)現(xiàn)。因此，高靈敏度和特異性的HBV DNA 定量檢測(cè)方法有助于臨床判斷患者病情發(fā)展和治療效果，更精準(zhǔn)地判斷停藥時(shí)機(jī)。

本研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)低載量慢性乙肝患者中，男性患者占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，比例為63.50%（499/707），基因分型以C 基因型占比最高60.53%（428/707），基因型分布與本地區(qū)相關(guān)研究報(bào)告[10]結(jié)果基本一致，而與有關(guān)研究顯示：我國南方以B 型為主，北方以C 型為主，D 型主要見于部分少數(shù)民族地區(qū)和西藏[11]的情況則有所不同，這說明HBV 基因型分布一定程度上受到地域分布差異的影響。同時(shí)，有很多研究[12-15]表明，相對(duì)乙肝其它型別患者，HBV C 型比患者更容易發(fā)生肝硬化、肝癌，所占的比例最高。在患者中，云南省及昆明地區(qū)的乙肝感染實(shí)際情況是以C 型感染為主，這就提示在臨床治療過程中，需要加強(qiáng)制定針對(duì)性臨床治療預(yù)防和控制措施。

部分可能存在“低病毒血癥”的慢乙肝患者，因?yàn)轶w內(nèi)的HBV DNA 持續(xù)或者間歇性地大于檢測(cè)下限，但又小于2000 IU/mL，就可能導(dǎo)致應(yīng)答不佳[1]。在707 例持續(xù)低載量慢性乙肝患者中，HBV DNA ＜ 2 000 IU/mL 的患者共有576 例，占（81.90%），出現(xiàn)了低病毒血癥。我國專家共識(shí)[16]一致認(rèn)為進(jìn)行長(zhǎng)期的抗乙肝病毒治療以后，患者的 HBV DNA 應(yīng) ＜ 20 IU/mL，而據(jù)有關(guān)研究表明[17-19]，有20%～37.9%使用如替諾福韋、恩替卡韋等一線抗乙肝病毒核苷類藥物治療的患者，仍然長(zhǎng)期處于低病毒血癥狀態(tài)。這種狀態(tài)的持續(xù)，可能會(huì)進(jìn)一步引起患者發(fā)生肝纖維化、肝硬化等病變。因此本研究采用檢測(cè)下限是20 IU/mL 的高敏HBV DNA 載量檢測(cè)方法，可以避免漏掉一部分病毒載量20～1 000 IU/mL 的患者，使其能被盡早發(fā)現(xiàn)，盡早治療。

目前的研究[20-21]普遍認(rèn)為HBsAg 陽性是HBV 感染的血清標(biāo)志，HBsAg 定量檢測(cè)在慢乙肝患者診斷、治療、預(yù)后等方面的臨床意義是臨床研究的熱點(diǎn)。本研究196 例HBeAg 為陽性且HBV DNA ＜ 2 000 IU/mL 患者組中有52 例患者HBV DNA ＜ 20 IU/mL，但其 HBsAg 均為陽性，HBsAg 定量為10～99、100～999、1 000～9 999 IU/mL 的患者占比分別為7.65%、25.51%和51.53%，提示在極低病毒載量水平的慢乙肝患者中，HBsAg 的實(shí)際表達(dá)和清除速率并不能同步反映乙肝病毒載量的變化情況。造成這種情況的原因，可能與相關(guān)研究[22]發(fā)現(xiàn)的結(jié)論是相同的，即處于低復(fù)制期的很多患者 HBV DNA 載量明顯降低，但只有部分患者HBsAg 定量有緩慢降低的趨勢(shì)，可實(shí)現(xiàn)HBsAg 清除。另外，盧建華等研究[23]指出，當(dāng) HBsAg 在 0～5 000 IU/mL 時(shí)是治療乙肝的關(guān)鍵時(shí)期，應(yīng)嚴(yán)密監(jiān)測(cè)此范圍患者的病情變化，根據(jù)變化及時(shí)采取措施進(jìn)行控制。本研究結(jié)果也提示在臨床治療過程中，HBsAg 可作為乙肝低病毒載量患者病情轉(zhuǎn)歸的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

通過對(duì)本研究中707 例持續(xù)低載量的的慢性乙肝患者的臨床指標(biāo)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，HBeAg 陽性率、ALT 異常率、耐藥位點(diǎn)和其它位點(diǎn)突變率在各個(gè)不相同乙肝病毒載量水平組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。高敏HBV DNA ＜ 2 000 IU/mL 的患者共有576 例，其中HBeAg 陽性者196 例（34.03%）。在196 例HBeAg 為陽性且HBV DNA ＜ 2 000 IU/mL 患者組中，男性為主，占69.89%，年齡多集中在30～60 歲，這種情況與慢性乙肝自然史的發(fā)展趨勢(shì)相符合。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，在HBV DNA ＜ 2 000 IU/mL 且 HBeAg 為陽性的患者，其乙肝病毒載量相對(duì)較高，有73.47%的患者HBV DNA ＞ 20 IU/mL，顯示出HBeAg 與HBV DNA 之間息息相關(guān)，恰好符合慢乙肝病程從免疫耐受期演變到免疫清除期的發(fā)展規(guī)律。ALT 主要存在于人體肝細(xì)胞內(nèi)，可準(zhǔn)確反映肝功能損傷程度，是一種能夠?qū)Φ筒《据d量慢性乙肝患者肝功能損傷程度進(jìn)行準(zhǔn)確反映的最靈敏度指標(biāo)之一[24]，但經(jīng)本研究結(jié)果統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在HBV DNA ＜ 500 IU/mL 且發(fā)生耐藥突變的患者組別中，ALT 異常率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），提示ALT 的異常不能完全準(zhǔn)確反映病毒低水平復(fù)制狀態(tài)下的患者，其體內(nèi)病毒復(fù)制的情況。在HBV DNA 20～99 IU/mL 和HBV DNA 100～499 IU/mL 患者中，耐藥位點(diǎn)和其它位點(diǎn)突變率較高，與相關(guān)文獻(xiàn)[25]研究報(bào)導(dǎo)相一致，耐藥突變的發(fā)生會(huì)引起病毒載量下降，因此臨床在治療過程中僅僅依據(jù)患者血清乙肝病毒載量的結(jié)果，是難以判斷病毒學(xué)突破的，并且如果患者體內(nèi)病毒載量呈現(xiàn)反復(fù)的低水平波動(dòng)，就將難以預(yù)測(cè)其肝損情況和預(yù)后效果，因此臨床需加強(qiáng)關(guān)注此類患者其它相關(guān)肝病的臨床指標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)部分患者即使體內(nèi)病毒含量極低，也存在一定比例的病毒耐藥位點(diǎn)突變。所以，持續(xù)低病毒血癥是否就會(huì)誘導(dǎo)乙肝病毒耐藥發(fā)生呢？乙肝病毒基因型、治療藥物種類等因素與持續(xù)低病毒血癥是又有怎樣的確切關(guān)系，還有待筆者將來進(jìn)一步研究。

綜上所述，對(duì)持續(xù)低水平病毒血癥的慢性乙型肝炎患者，選擇高敏的PCR 技術(shù)定期監(jiān)測(cè)持續(xù)低水平病毒血癥患者的乙肝病毒HBV DNA，結(jié)合HBeAg、HBsAg、ALT 等臨床指標(biāo)的定量監(jiān)測(cè)，有助于延緩患者疾病的進(jìn)展過程，有效降低患者肝臟的病理性損傷，從而獲得更佳的治療效果。