生物傳感器應(yīng)用于醬香型酒醅中乳酸、乙醇、葡萄糖的分析研究

羅文業(yè)，沈 毅，羅 華，陳永江，陳 振，徐 源，楊 梨，劉一二，田 雪

（1.四川郎酒股份有限公司，四川古藺 646523；2.四川省醬香型白酒生態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川古藺 646523）

醬香型白酒的生產(chǎn)秉承傳統(tǒng)工藝，釀造過程嚴(yán)格按“12987”工藝進(jìn)行，即整個(gè)生產(chǎn)過程需要完成兩次投糧、九次蒸煮、八次發(fā)酵、七次取酒[1]。在生產(chǎn)過程中酒醅發(fā)酵情況對(duì)出酒率和酒質(zhì)都起著至關(guān)重要的作用。目前大多數(shù)酒廠對(duì)發(fā)酵情況的理化指標(biāo)監(jiān)控主要是水分、酸度、殘?zhí)?、淀粉，檢測(cè)方法所耗時(shí)間較長(zhǎng)，不能迅速地反應(yīng)酒醅的發(fā)酵情況，不利于生產(chǎn)釀造。

本實(shí)驗(yàn)通過研究采用生物傳感器分析儀[2]，建立酒醅中葡萄糖、L-乳酸及乙醇含量的快檢分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒醅樣品：醬香型1～7次出池、入池酒醅。

試劑及耗材：緩沖液粉末：緩沖鹽，抗生素；葡萄糖、乳酸、乙醇混合定標(biāo)液：1 g/L、1 g/L、0.5 g/L；葡萄糖粉：分析純；乙醇：優(yōu)級(jí)純；乳酸：色譜純；葡萄糖電極酶膜；乳酸電極酶膜；乙醇電極酶膜；漏斗；定量濾紙：D12.5 cm。

儀器設(shè)備：生物傳感器分析儀(M-100)，電子天平(感量0.1 mg)，離心機(jī)(TD5A)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 配制緩沖液

將20 g 緩沖液粉末倒入1 L 試劑瓶?jī)?nèi)，確保所有緩沖液粉末進(jìn)入試劑瓶?jī)?nèi)，上下顛倒晃動(dòng)試劑瓶，使試劑瓶中的緩沖液充分溶解，放置2 h后方可使用。

1.2.2 配制葡萄糖、乳酸、乙醇混合水溶液（準(zhǔn)確度驗(yàn)證用）

用純水分別配制0.10 g/L、0.50 g/L、1.00 g/L 的葡萄糖、乳酸、乙醇混合水溶液。

1.2.3 樣品的前處理

稱取10.00 g酒醅于250 mL燒杯中，加50.0 mL水，攪勻，室溫下靜置浸泡30 min，中間每隔10 min攪拌一次，用定量濾紙過濾，以150 mL 三角瓶接取濾液，離心取上清液備用。

1.2.4 樣品的測(cè)定

取葡萄糖、乳酸、乙醇混合標(biāo)準(zhǔn)液，用吸管吸取標(biāo)準(zhǔn)液（不少于500 μL）加入樣品杯中，將標(biāo)準(zhǔn)液放至生物傳感器分析儀定標(biāo)位。將處理好的樣品用吸管吸取上清液（不少于500 μL）加入樣品杯中，將樣品液放至生物傳感器分析儀樣品位。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品放置完畢后，點(diǎn)擊主菜單界面中的“測(cè)試”圖標(biāo)，再點(diǎn)擊樣本所在杯位編號(hào)，儀器會(huì)自動(dòng)進(jìn)行定標(biāo)校準(zhǔn)，并完成測(cè)試。

1.2.5 檢測(cè)原理

采用特殊設(shè)計(jì)的生物氧化酶膜電化學(xué)傳感器對(duì)待測(cè)樣品濃度進(jìn)行檢測(cè)。儀器自動(dòng)采集樣本并導(dǎo)入至測(cè)試區(qū)域，樣本中所含的待測(cè)物質(zhì)在固定化生物氧化酶的催化下發(fā)生酶解反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫，電極檢測(cè)生成的過氧化氫濃度從而計(jì)算待測(cè)物質(zhì)含量。儀器通過對(duì)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的電壓值是衡量待測(cè)物質(zhì)濃度的尺度，未知濃度可與標(biāo)準(zhǔn)品的電壓信號(hào)相比較而獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的準(zhǔn)確性、精密度試驗(yàn)

將濃度為0.10 g/L、0.50 g/L、1.00 g/L 的葡萄糖、乳酸、乙醇混合水溶液分別連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣分析10次，結(jié)果見表1、表2、表3。計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）衡量方法的精密度，采用t 檢驗(yàn)法評(píng)價(jià)準(zhǔn)確性。從表1、表2、表3 可以看出，3 個(gè)濃度的葡萄糖、乳酸、乙醇混合水溶液相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 值均比較小，3 個(gè)濃度的混合水溶液自由度為f=9，包含概率為95 %時(shí)，計(jì)算得到的t 值均小于tf95(該符號(hào)表示概率為95 %時(shí)的某一自由度下的tp（v）值即不確定值)。由此可以看出，該方法檢測(cè)分析葡萄糖、乳酸、乙醇的準(zhǔn)確性和精密度都比較良好，滿足分析要求。

表1 3個(gè)濃度的混合水溶液葡萄糖分析結(jié)果

表2 3個(gè)濃度的混合水溶液乳酸分析結(jié)果

表3 3個(gè)濃度的混合水溶液乙醇分析結(jié)果

2.2 方法加標(biāo)回收試驗(yàn)

取已知含量入池酒醅、出池酒醅各一個(gè)，分別添加一定量葡萄糖、乳酸、乙醇混合水溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算樣品加標(biāo)回收率。表4 是樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果，葡萄糖回收率在90.0%～102.0%，乳酸回收率在90.0 %～110.0 %，乙醇回收率在90.0 %～110.0 %，各項(xiàng)數(shù)據(jù)均說明該方法的回收率比較良好。

表4 樣品加標(biāo)回收率

2.3 不同輪次醬香酒醅的入池酒醅、出池酒醅分析結(jié)果對(duì)比

在1～7 輪次酒醅中，每個(gè)輪次隨機(jī)抽取入池酒醅、出池酒醅各3 個(gè)，進(jìn)行前處理后，采用生物傳感器分析儀檢測(cè)分析。表5 為1～7 輪次酒醅入池糟、出池糟檢測(cè)分析結(jié)果。從表5 可以看出，不同輪次的入池酒醅、出池酒醅的葡萄糖、乳酸、乙醇具有一定的差異，可以通過出池酒醅的葡萄糖、乳酸、乙醇的含量初步判斷本輪次酒醅的發(fā)酵情況，同時(shí)結(jié)合該輪次酒醅出酒的質(zhì)量，可為制定酒醅控制指標(biāo)提供數(shù)據(jù)支持。

表5 不同輪次入池酒醅、出池酒醅分析結(jié)果比較

2.4 酶膜壽命（酶膜的活性)試驗(yàn)

2.4.1 樣品檢測(cè)數(shù)量試驗(yàn)

在正常使用條件下，更換新酶膜，隨機(jī)抽取酒醅進(jìn)行前處理后上機(jī)分析，邊分析邊查看葡萄糖、乳酸、乙醇電極定標(biāo)電壓差（標(biāo)液電壓與空白電壓的差值）。表6 為葡萄糖、乳酸、乙醇酶膜分析樣品達(dá)到一定數(shù)量時(shí)葡萄糖、乳酸、乙醇電極定標(biāo)電壓差。

表6 分析不同樣品數(shù)量時(shí)葡萄糖、乳酸、乙醇電極定標(biāo)電壓差

從表6 可以看出，在分析樣品達(dá)到1100 個(gè)后，乙醇電極定標(biāo)電壓差下降至38 mV，1200 個(gè)后乙醇電極定標(biāo)電壓下降至30 mV 以下，說明乙醇酶膜已經(jīng)失去活性，需要更換新酶膜；在分析樣品達(dá)到2800 個(gè)后，乳酸電極定標(biāo)電壓差下降至38 mV，2900個(gè)后乳酸電極定標(biāo)電壓下降至30 mV以下，說明此時(shí)乳酸酶膜已經(jīng)失去活性，需要更換新酶膜；在分析樣品達(dá)到3000 個(gè)后，葡萄糖電極定標(biāo)電壓差下降至38 mV，3100 個(gè)后葡萄糖電極定標(biāo)電壓下降至30 mV 以下，說明葡萄糖酶膜已經(jīng)失去活性，需要更換新酶膜。由此可以看出，3 種酶膜可以分析樣品的數(shù)量是不一樣的，葡萄糖酶膜可以分析樣品數(shù)量最多，可達(dá)3000 個(gè)左右，乳酸酶膜2800 個(gè)左右，乙醇酶膜最少，只有1100個(gè)左右。

2.4.2 酶膜上機(jī)壽命試驗(yàn)

在正常使用條件下，更換新酶膜，開機(jī)待機(jī)，然后每隔5 d定標(biāo)并分析樣品，記錄電極定標(biāo)電壓差，表7 為葡萄糖、乳酸、乙醇酶膜每隔5 d 的電極定標(biāo)電壓差。

表7 待機(jī)測(cè)試葡萄糖、乳酸、乙醇電極定標(biāo)電壓差

從表7 可以看出，在酶膜上機(jī)不分析樣品的情況下，待機(jī)20 d 時(shí)，乙醇電極定標(biāo)電壓差下降至30 mV 以下，說明乙醇酶膜已經(jīng)失去活性，需要更換新酶膜；第30 天，乳酸電極定標(biāo)電壓差下降至30 mV 以下，說明乳酸酶膜已經(jīng)失去活性，需要更換新酶膜；第35 天，葡萄糖電極定標(biāo)電壓差下降至30 mV 以下，說明葡萄糖酶膜已經(jīng)失去活性，需要更換新酶膜。由此可以看出3 種酶膜上機(jī)不分析樣品達(dá)到一定時(shí)間時(shí)，葡萄糖、乳酸、乙醇酶膜也會(huì)失去活性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用生物傳感器分析儀分析醬香型不同輪次出、入池酒醅中的葡萄糖、乳酸、乙醇含量。從分析結(jié)果可以看出，不同輪次的入池酒醅、出池酒醅的葡萄糖、乳酸、乙醇具有一定的差異，入池酒醅的葡萄糖基本比出池酒醅高，入池酒醅的乙醇比出池酒醅乙醇低，乳酸波動(dòng)大。

通過方法的準(zhǔn)確性、精密度，以及加標(biāo)回收試驗(yàn)，表明該方法的準(zhǔn)確性、精密度和回收率都比較良好；同時(shí)，通過酶膜壽命（酶膜的活性)試驗(yàn)，可以看出不同酶膜達(dá)到一定的使用次數(shù)或待機(jī)時(shí)間后，酶膜就要更換。