消栓再造丸質量標準提升研究

欒 潔，浦 潔，殷紅軍

（江蘇省無錫市藥品安全檢驗檢測中心，江蘇 無錫 214028）

消栓再造丸屬國家中藥保護品種，由血竭、黃芪、天麻、朱砂等38味藥材組方，始載于《北京市藥品標準》（1983年版），由同仁堂制藥廠于1980年研制而成（且為其保密方）。方中血竭（含有血竭素、血竭紅素等黃酮類衍生物成分）活血祛瘀通經；天麻平肝熄風，祛痰解痙；黃芪補氣行滯。全方具有活血化瘀、熄風通絡、補氣養血、消血栓功效，臨床多用于治療氣虛血滯、風痰阻絡引起的中風后遺癥（癥見肢體偏癱、半身不遂、口眼喎斜、言語障礙、胸中郁悶等）。其現行質量標準［1］項目設置簡單，除【性狀】、【檢查】項外，僅對制劑中的部分藥味進行顯微鑒別。為此，本研究中采用薄層色譜（TLC）法對方中黃芪、天麻進行定性鑒別［2-9］，采用高效液相色譜（HPLC）法測定方中血竭素的含量［10-12］，為制劑的質量標準改進提供參考。現報道如下。

1 儀器與材料

儀器：Waters 2695 型高效液相色譜儀，包括四元低壓梯度泵、自動進樣器、柱溫箱和二極管陣列檢測器（美國Waters 公司）；XS205DU 型電子天平、XP-6 型精密電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；ATS 4 型薄層自動點樣儀、ADC 2 型全自動展開儀（瑞士CAMAG 公司）；S100H型數控超聲波清洗器（德國Elma公司）。

試藥：消栓再造丸（北京某藥廠，批號分別為16013615，17013437，17013929，17013930，17013964，18013108，18013110，18013437，18013533，18013639）。預制硅膠G 板（100 mm×100 mm，德國Merck 公司）；黃芪甲苷對照品（批號為110781-201717，含量96.9%）、天麻素對照品（批號為110807-201809，含量96.7%）、血竭素高氯酸鹽對照品（批號為110811-201707，含量96.3%，血竭素含量=血竭素高氯酸鹽的含量/1.377），天麻對照藥材（批號為120944-201611），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為自制超純水。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

黃芪：取樣品6 g，剪碎，加入40 mL甲醇，水浴加熱回流1 h，用濾紙濾過，取濾液濃縮至約10 mL，置中性氧化鋁柱（100～120 目，5 g，內徑為15 mm）上，用100 mL 40%甲醇洗脫，取洗脫液，蒸干；殘渣加30 mL 水使溶解，再用20 mL 水飽和的正丁醇振搖提取2 次，合并正丁醇提取液，再用水洗滌2 次，棄去水液，取正丁醇液，蒸干；殘渣加0.5 mL 甲醇使溶解，即得供試品溶液。取黃芪甲苷對照品約5 mg，置5 mL容量瓶中，加甲醇制成1 mg/ mL 的對照品溶液。按消栓再造丸處方和工藝制備缺黃芪的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502［12］，吸取上述3 種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）的下層溶液為展開劑，展開，取出，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光燈及紫外光燈（365 nm）下檢視。結果，供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置處顯相同顏色斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1。

圖1 黃芪薄層色譜圖1-3.Test solution 4.Astragaloside Ⅳreference solution 5 Negative reference solutionA.Fluorescent lamp B.Ultraviolet lamp（365 nm）Fig.1 TLC chromatograms of Astragali Radix

天麻：取樣品10 g，剪碎，加等量硅藻土，研勻，稱取2 g，加10 mL 70%甲醇超聲（功率250 W，頻率40 kHz，下同）處理30 min，濾過，取濾液，即得供試品溶液。取天麻素對照品約5 mg，置5 mL 容量瓶中，加甲醇制成1 mg/mL的對照品溶液。取天麻對照藥材0.5 g，按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按消栓再造丸處方和工藝制備缺天麻的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502，取上述供試品溶液及陰性對照品溶液各15 μL，對照品溶液5 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（9∶1∶3，V/V/V）為展開劑，展開，取出，噴以磷鉬酸乙醇試液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置日光燈下檢視。結果，供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置處顯相同顏色斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖2。

圖2 天麻薄層色譜圖1-3.Test solution 4.Reference medicinal material solution of Gastrodiae Rhizoma 5.Gastrodin reference solution 6.Negative reference solutionFig.2 TLC chromatograms of Gastrodiae Rhizoma

2.2 血竭素含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.05 mol/ L 磷酸二氫鈉溶液（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：440 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取血竭素高氯酸鹽12.770 mg，精密稱定，置25 mL棕色容量瓶中，以10%磷酸甲醇溶液溶解并定容，制成血竭素高氯酸鹽質量濃度為0.491 9 mg/mL（血竭素質量濃度為0.357 2 mg/mL）的對照品溶液。取樣品10 g，剪碎，精密稱定，加入硅藻土10 g，精密稱定質量，充分研勻后精密稱取4 g，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 10%磷酸甲醇溶液，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，水浴回流30 min，放冷至室溫，再次稱定質量，用10%磷酸甲醇溶液補足缺失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按處方和工藝制備缺血竭的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：取上述對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應色譜峰，且陰性對照無干擾，表明專屬性良好。詳見圖3。

圖3 高效液相色譜圖1.DracorhodinA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密量取2.2.2 項下對照品溶液，以10%磷酸甲醇溶液制成含血竭素1.428 9，3.572 3，7.144 5，35.722 6，71.445 2，178.613 1 μg/mL 的系列對照品溶液。精密量取10 μL，按2.2.1項下色譜條件進樣測定。以血竭素質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=2.288×104X-1.263 × 103（r=0.999 9）。結果表明，血竭素質量濃度在1.428 9～178.613 1 μg/mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

定量限與檢測限考察：分別精密量取對照品溶液適量，倍比稀釋，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，以信噪比10∶1、3∶1 時的待測成分質量濃度分別記作定量限、檢測限。結果血竭素的定量限和檢測限分別為0.589 4 μg/mL，0.176 8 μg/mL。

精密度試驗：取2.2.2 項下對照品溶液適量，按2.2.1項下色譜條件進樣測定6次，記錄峰面積。結果血竭素峰面積的RSD為0.71%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取供試品溶液（批號為17013437）適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12 h時按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果血竭素峰面積的RSD為2.70%（n=5），表明供試品溶液在室溫放置12 h內基本穩定。

重復性試驗：精密稱取樣品（批號為17013437）適量，各6 份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算血竭素含量。結果血竭素平均含量為62.04 μg/g，RSD為0.84%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量樣品（批號為17013437）適量，共9 份，以當前取樣含量的1∶0.5、1∶1、1∶1.5，精密加入2.2.2 項下對照品溶液適量，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.2.4 樣品含量測定

取10 批樣品各適量，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（μg/g，n=2）Tab.2 Results of content determination of dracorhodin in the samples（μg/g，n=2）

3 討論

定性鑒別中，由于樣品中含38 味藥材且均為原粉入藥，故對其制備和展開條件進行了探索。在制備黃芪的供試品溶液時，樣品的提取曾嘗試用甲醇回流液濃縮直接點樣展開，但由于處方中含眾多藥味，薄層展開時干擾較多，故采用濾液過中性氧化鋁柱的方式凈化供試品溶液，獲得較好的TLC圖譜；展開條件的考察中，鑒別黃芪時對不同展開系統［三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10，V/V/V/V）置10 ℃以下的下層溶液、三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）置10 ℃以下的下層溶液、二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（25∶5∶10∶0.2，V/V/V/V）］、鑒別天麻時對不同展開系統［三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（8∶1∶3∶0.1，V/V/V/V）、三氯甲烷-甲醇（3∶1，V/V）、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（9∶1∶3，V/V/V）］進行考察，同時對不同廠家薄層板（青島海洋廠、德國默克公司、德國MN 公司產硅膠G薄層板）、不同溫度（8 ℃、25 ℃、30 ℃）、不同相對濕度（32%，52%，65%）進行了考察，結果表明，篩選的薄層色譜條件重現性好，分離效能高，可用于消栓再造丸的定性鑒別。

定量測定中，曾嘗試取樣品，直接加入不同體積分數的磷酸甲醇溶液提取制備供試品溶液，但因樣品中含蜜量較高，直接提取樣品易結塊，提取效率低，故采用加入硅藻土吸附糖分，使樣品容易分散，提高提取效率。在樣品制備的過程中，考察了取樣量、加入溶劑的體積分數、體積及提取方式。具體為取樣品適量，剪碎，加入等量硅藻土，混勻，取約2 g、4 g、6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入不同體積分數（3%，5%，10%，12%）的磷酸甲醇溶液各25 mL 或50 mL，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質量，用相應的溶劑補足減失的質量，搖勻，離心，取上清液，即得。結果表明，取樣量為4 g 時，加10%磷酸甲醇溶液25 mL，供試品中血竭素的提取效果最好；比較了取樣量為4 g時，以10%磷酸甲醇溶液為溶劑超聲處理30 min、加熱回流30 min、先加熱回流30 min 再超聲處理30 min 的提取效果。結果表明，供試品取樣量為4 g，采用10%磷酸甲醇溶液為溶劑，先加熱回流30 min再超聲處理30 min，血竭素的提取效果最好，可用于測定消栓再造丸中血竭素含量的。

綜上所述，所建標準準確、簡便、重復性好，可用于完善消栓再造丸的質量標準。