枸櫞酸莫沙必利片雜質研究*

劉阿利，王 雪，張貴民

（1.魯南貝特制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.國家手性制藥工程技術研究中心，山東 臨沂 276006；3.藥物新制劑研發山東省工程研究中心，山東 臨沂 276006）

枸櫞酸莫沙必利為選擇性5-羥色胺4（5-HT4）受體激動劑，可增強上消化道的胃排空和蠕動，促進腸道膽堿能神經元釋放乙酰膽堿，刺激胃腸道而發揮促動力作用［1］。其選擇性強，不良反應少，耐受性較好，促胃動力作用強，主要用于緩解慢性胃炎伴有的消化系統癥狀，也可用于胃食管反流性疾病、糖尿病性胃輕癱及部分胃切除患者的胃功能障礙［2-5］。該制劑1998 年在日本上市，商品名Gasmotin?；2001 年在中國上市，中文名加斯清?［6］。目前，中國、歐洲、美國等的藥典均未收載，日本藥典（JP17 版）雖有收載，但也未對特定雜質作明確規定。一致性評價參照日本藥典（JP17 版）“Mosapride Citrate Tablets”質 量 標 準［7］及 日 本IF 文件［8］，建立本品有關物質檢查方法，主要對5種特定雜質進行研究，結果特定雜質莫沙必利檸檬酰胺在液相色譜圖中顯示2個色譜峰，但是否均為莫沙必利檸檬酰胺，雙峰出現的原因以及是否影響該雜質含量的計算等問題仍需進一步研究。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法和超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（UPLC -Q-TOF-MS）法對莫沙必利檸檬酰胺在有關物質液相檢測條件下顯示的2個色譜峰進行研究，為枸櫞酸莫沙必利片后續相關質量標準研究提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters ACQ -2489 型高效液相色譜儀，配備紫外檢測器（美國Waters 公司）；超高效液相色譜-四極桿串聯飛行時間質譜聯用儀，包括1290 型超高壓液相色譜系統（配備DAD 檢測器）、6540BQ-TOF 型四極桿串聯飛行時間質譜系統（配備電噴霧離子源）、Mass Hunter工作站軟件（美國Agilent 公司）；XS105 型電子天平、S210型酸度計（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥

枸櫞酸莫沙必利片（自制，批號分別為170701，170702，170703）；莫沙必利檸檬酰胺對照品（加拿大TRC 公司，批號為15 -THT -139 -2，含量94.54%）；甲酸、乙酸銨、乙腈均為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 檢測條件

2.1.1 HPLC 條件

色譜柱：Agilent C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；檢測器：紫外檢測器；流動相：枸櫞酸鹽溶液（A，取枸櫞酸鈉8.82 g，加水800 mL 使溶解，用稀鹽酸調pH 至4.0，加水至1 000 mL）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：274 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。理論板數按莫沙必利峰計應不低于40 000。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

2.1.2 UPLC-Q-TOF-MS 條件

色譜條件：色譜柱為YMC-Triant C18柱（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）；檢測器為DAD 檢測器；流動相為含0.1%甲酸的10 mmol/L 乙酸銨（A）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速為0.5 mL/min；檢測波長為274 nm；柱溫為40 ℃；進樣量為0.5 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution program

質譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描模式（ESI+）；二級質譜碰撞能量30 eV；毛細管電壓4 kV；錐孔電壓45 V；碎裂電壓60 V；干燥氣流速8 mL/min；干燥氣溫度300 ℃；霧化氣壓力35 psi；掃描模式MS/MS；掃描范圍m/z50～700。

2.2 溶液制備

取樣品細粉適量，精密稱定，加乙腈-水（40∶60，V/V）溶解并稀釋，制成每1 mL 中約含枸櫞酸莫沙必利1 mg 的溶液，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。精密量取適量供試品溶液，用乙腈-水（40∶60，V/V）定量稀釋，制成每1 mL 中約含5 μg 的溶液，即得對照溶液。取莫沙必利檸檬酰胺對照品約10 mg，精密稱定，置20 mL容量瓶中，加乙腈-水（40∶60，V/V）溶解并定容，搖勻，即得對照品溶液。

2.3 有關物質檢測

精密量取2.2 項下對照溶液適量，按2.1.1 項下HPLC 條件進樣，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的10%～20%；再精密量取2.2 項下供試品溶液和對照溶液，按2.1.1 項下HPLC 條件進樣測定，記錄色譜圖，見圖1，分別按保留時間定位主峰及各雜質峰。可見，莫沙必利檸檬酰胺峰定位處顯示2 個明顯的色譜峰，保留時間分別為8.434 min 和8.665 min。有文獻指出，莫沙必利檸檬酰胺為一對對映異構體，在色譜行為上表現為2個峰［9］。但從莫沙必利檸檬酰胺結構看并非如此（因不含手性中心）。因此，其色譜圖中出現雙峰的原因仍需進一步研究。

圖1 樣品有關物質高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of related substances in samples

2.4 雙峰質譜解析

取2.2項下對照品溶液適量，按2.1.2項下UPLCQ -TOF -MS 條件進樣分析，記錄液相色譜圖及一級（MS1）和二級（MS2）質譜圖，見圖2和圖3。

圖2 對照品溶液高效液相色譜圖1，2.Mosapride citric amideFig.2 HPLC chromatogram of reference substance

圖3 對照品溶液質譜圖1，2.Mosapride citric amideA，C.MS1 B，D.MS2Fig.3 Mass spectra of reference substance

液相色譜圖中在12.70 min 和12.76 min 處各出現1 個峰，分別命名為1 號峰和2 號峰。2 個峰一級質譜分子量均與莫沙必利檸檬酰胺相當，二級質譜主要碎片峰離子豐度相當，峰形相似，分子量均高度一致。初步推斷兩個色譜峰均為莫沙必利檸檬酰胺。

解析質譜，推斷莫沙必利檸檬酰胺可能有多種裂解途徑（如圖4）。按途徑a 進行碎裂，失去右側C20H26ClFN3O9基團后生成碎片m/z109.04，元素組成為C7H6F+。另外可能按途徑b 失去左側C12H17FN2O 基團后生成碎片m/z372.05，進而繼續破裂，生成1 個碎片m/z175.02，元素組成為C6H7O6+；另一碎片獲得1 個氫得到碎片m/z198.03，元素組成為C9H9ClNO2+。莫沙必利檸檬酰胺可能的裂解碎片分子量與質譜圖中二級碎片離子分子量一致，吻合度較高，因此進一步確定2個峰均為莫沙必利檸檬酰胺。

圖4 莫沙必利檸檬酰胺可能的裂解途徑Fig.4 Possible fragmentation pathway of mosapride citric amide

2.5 雙峰存在型式確認

本研究中所用的莫沙必利檸檬酰胺對照品為莫沙必利檸檬酰胺二鈉鹽，羧酸鈉鹽為弱酸強堿鹽，溶液狀態時存在解離現象，在流動相pH 環境中可能有3 種存在型式，各型式之間存在解離平衡，見圖5。調節流動相A的pH 分別為2.5，3.0，3.5，3.8，4.0，4.2，4.5，5.0，5.5，6.5，取2.2 項下對照品溶液，按2.1.1 項下HPLC條件進樣分析，結果見表3。

表3 不同流動相pH下莫沙必利檸檬酰胺對照品溶液峰面積Tab.3 The peak area of mosapride citric amide reference substance under different pH values and mobile phases

圖5 莫沙必利檸檬酰胺對照品溶液可能存在的解離平衡Fig.5 Possible dissociation equilibrium of mosapride citric amide reference substance

根據莫沙必利檸檬酰胺分子結構特征推測，其未解離型式（Ⅰ）僅在低pH 環境中穩定存在。在有關物質色譜項下的pH 環境中，主要以Ⅱ和Ⅲ兩種型式存在。在不同pH 環境中，Ⅱ和Ⅲ的比例不同，出峰時間略有差異，液相色譜圖峰面積比例也發生顯著變化。當流動相A 的pH 在2.5～5.0 范圍內，液相譜圖中莫沙必利檸檬酰胺始終表現為雙峰，即以Ⅱ和Ⅲ兩種型式存在；隨著流動相pH 的升高，型式Ⅲ的峰面積相對增大，而型式Ⅱ的峰面積相對減小；當流動相A 的pH ≥5.5時，莫沙必利檸檬酰胺液相色譜圖由雙峰變成單峰，此時2 個羧酸根已完全解離，主要以解離的型式（Ⅲ）存在。因此，莫沙必利檸檬酰胺在有關物質檢查液相色譜條件下（pH 4.0）顯示雙峰。

2.6 方法學考察

線性關系考察：精密量取2.2項下對照品溶液5 mL，置50 mL 容量瓶中，加乙腈-水（40∶60，V/V）定容，搖勻，即得對照品貯備液；精密量取0.1，0.3，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0 mL，分別置10 mL 容量瓶中，加乙腈-水（40∶60，V/V）定容，搖勻，制得系列對照品溶液。按2.1.1 項下HPLC 條件進樣分析，以峰面積（A）為縱坐標，莫沙必利檸檬酰胺質量濃度（C，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程A=12 926.72C-926.87（r=0.999 7，n=7）。結果表明，莫沙必利檸檬酰胺質量濃度在0.35～7.00 μg/ mL（相當于供試品溶液0.035%～0.70%）范圍內與峰面積線性關系良好。根據線性回歸方程中的斜率，計算莫沙必利檸檬酰胺校正因子為1.10，在0.9～1.1范圍內，可采用不加校正因子的主成分自身對照法計算該雜質含量。

強制降解試驗：稱取樣品細粉適量（約相當于枸櫞酸莫沙必利10 mg），精密稱定，置10 mL容量瓶中，平行5 份，分別進行熱降解（80 ℃烘箱下放置48 h，溶劑定容）、酸降解（2 mL 溶劑，1 mL 1 mol/ L HCl，90 ℃加熱30 min，冷卻中和，溶劑定容）、氧化降解（2 mL 溶劑，2 mL 3%H2O2，90 ℃加熱5 min，冷卻，溶劑定容）、堿降解（2 mL溶劑，1 mL 0.1 mol/L NaOH，90 ℃加熱10 min，冷卻中和，溶劑定容）、光降解（溶劑定容，4 500 lx 光照箱中照射64 h）試驗。按2.1.1 項下HPLC 條件進樣分析，記錄色譜圖。結果表明在該色譜條件下主峰與相鄰雜質峰之間的分離度符合要求。

定量限和檢測限考察：取2.2 項下對照品溶液適量，逐級稀釋，按2.1.1 項下HPLC 條件進樣分析，記錄峰面積。以信噪比（S/N）約為3 或10 時待測成分的進樣量分別作為檢測限與定量限，結果莫沙必利檸檬酰胺的檢測限為0.70 ng，定量限為2.8 ng。

精密度試驗：精密量取2.6項下對照品貯備液0.2，1.0，1.5 mL，分別置10 mL 容量瓶中，加乙腈-水（40∶60，V/V）定容，搖勻，作為精密度20%，100%，150%的供試品溶液，各平行3 份，按2.1.1 項下HPLC條件進樣分析，記錄峰面積。結果莫沙必利檸檬酰胺峰面積的RSD分別為3.96%、0.07%、0.45%（n=3），表明在20%～150% 體積分數范圍內儀器精密度較好。

耐用性考察：取2.2項下對照品溶液適量，按2.1.1項下HPLC 條件進樣分析。調節流動相A 的pH 為3.8，4.0，4.2，記錄莫沙必利檸檬酰胺峰面積之和的變化，考察方法耐用性。結果，流動相A 的pH 在3.8～4.2 范圍內變化時，莫沙必利檸檬酰胺雙峰總面積的RSD為0.38%，證明該方法耐用性良好。

2.7 樣品含量測定

取3批樣品適量，各平行3份，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下HPLC 條件進樣分析，記錄峰面積，計算含量。結果批號170701，170702，170703 樣品中莫沙必利檸檬酰胺含量分別為0.006%，0.005%，0.007%。

3 討論

3.1 雙峰定性

雜質檢測是藥物質量控制的關鍵。液質聯用技術在雜質譜分析中的應用越來越廣泛，可推測藥物中存在的未知雜質結構［10-12］。本研究中建立的UPLC-QTOF-MS 法可有效地對枸櫞酸莫沙必利片有關物質色譜圖中莫沙必利檸檬酰胺的2個峰進行定性研究，可推導出兩個峰的結構。通過一級質譜圖可知，兩個峰的分子量均與莫沙必利檸檬酰胺一致；進一步推測莫沙必利檸檬酰胺可能的裂解途徑，各裂解碎片離子分子量與二級質譜圖中二級碎片離子分子量相當，確定色譜圖中雙峰均為莫沙必利檸檬酰胺峰。

3.2 雙峰分析

從莫沙必利檸檬酰胺結構看，其含有2 個羧酸基團，進入液相后，與流動相中的鈉離子生成羧酸鈉鹽，羧酸鈉鹽為弱酸強堿鹽，在不同pH 流動相中發生解離，可能存在保留時間各異的未解離（Ⅰ）、部分解離（Ⅱ）及完全解離（Ⅲ）3 種型式。隨著pH 的改變，各型式之間相互轉化，液相色譜圖中各峰面積的比例也發生顯著變化［13］。確定莫沙必利檸檬酰胺雙峰現象為其羧酸鈉鹽的不完全解離所致，液相譜圖中雙峰為莫沙必利檸檬酰胺的兩種存在型式（Ⅱ和Ⅲ），各型式之間存在解離平衡，在一定pH 條件下可相互轉化。這在一定程度上可為“色譜圖中，同一物質出現雙峰”的研究提供新的思路。

3.3 方法評價

本研究中建立了枸櫞酸莫沙必利片有關物質檢查的UPLC-Q-TOF-MS 法，并以此對特定雜質莫沙必利檸檬酰胺進行研究。采用不加校正因子的主成分自身對照法能快速、有效地檢出該雜質。色譜圖中雙峰均為莫沙必利檸檬酰胺，定量時以兩個峰面積之和計算，不會影響該雜質校正因子計算和檢測結果。因此，本研究可為枸櫞酸莫沙必利片雜質研究及其質量控制提供參考。