高效液相色譜-電噴霧檢測器法測定甲鈷胺注射液中甘露醇含量

顧曉風，李玥琦，田沛霖

（江蘇省蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州 215104）

甲鈷胺是維生素B12在體內的活性形式之一，可通過刺激神經細胞合成卵磷脂改善神經傳導速度，修復損傷后的髓鞘［1］。其制劑甲鈷胺注射液，臨床用于治療周圍神經病及因缺乏維生素B12引起的巨紅細胞性貧血，對2 型糖尿病（T2DM）引起的神經病變療效也較好［2-3］。注射用輔料具有賦形、提高穩定性、增溶助溶等重要功能，是影響藥品質量、安全性和有效性的重要成分［4］。甲鈷胺注射液中除注射用水外，還添加了甘露醇作為藥用輔料。甘露醇在注射劑中主要起填充劑［5］的作用，對藥物的穩定性有一定影響［6-7］。2020年5月，國家藥品監督管理局正式啟動化學仿制藥注射劑一致性評價［8］。建立準確有效的方法、研究注射劑輔料的種類和用量，對于保障產品的質量及完成一致性評價均有一定意義。電噴霧檢測器（CAD）是近年來興起的通用型檢測器，其對化合物的結構無特定要求，可檢測不揮發或半揮發性物質，特別適用于弱紫外吸收或無紫外吸收成分的分析，靈敏度高、穩定性和重復性好，結合高效液相色譜（HPLC）法已廣泛用于藥物分析領域［9-12］。本研究中建立了測定甲鈷胺注射液中甘露醇含量的HPLC -CAD 法，旨在為完善該制劑質量標準、保障其產品質量提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UltiMate 3000型高效液相色譜儀，配有Corona Veo RS電霧式檢測器，變色龍工作站（美國Thermo Fisher公司）；XS205DU 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，精度為0.01 mg）；Millipore Synergy 超純水機（密理博＜中國＞有限公司）。

1.2 試藥

甲鈷胺注射液（A 公司，批號分別為200611A，200204A，190405A）。甘露醇對照品（批號100533 -202006，含量為99.5%）、甲鈷胺對照品（批號100692 -201805，含量為92.8%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB -C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），流動相：15%乙腈（A）-80%乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。檢測器：CAD；霧化氣體：氮氣；蒸發管溫度：35 ℃；增益值：1；冪函數：1.0；采集頻率：10 Hz；過濾常數：3.6。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

2.2 溶液制備

對照品溶液：取甘露醇對照品約100 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，用流動相A 溶解并定容，搖勻，制成質量濃度為1.0 mg/mL的對照品溶液。

供試品溶液：精密量取甲鈷胺注射液1 mL，置100 mL容量瓶中，用流動相A定容，搖勻，作為供試品溶液。

空白對照溶液：取甲鈷胺對照品約10 mg，精密稱定，置20 mL 容量瓶中，用流動相A 溶解并定容，搖勻；精密移取1 mL，置100 mL 容量瓶中，用流動相A 定容，作為空白對照溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：取空白對照溶液、對照品溶液（甘露醇質量濃度為0.5 mg/ mL）和供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果目標物峰理論板數大于10 000，拖尾因子小于1.2，且空白對照無干擾，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Mannitol 2.MecobalaminB.Reference solution B.Test solution C.Blank control solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：分別精密量取甘露醇對照品溶液1，2，3，5，8 mL，置10 mL 容量瓶中，用流動相A 稀釋至刻度，搖勻，得系列對照品溶液。取10 μL 進樣測定，記錄峰面積，以對照品系列溶液的質量濃度（mg/mL）對數值（X）為橫坐標，以峰面積對數值（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=0.718 8X+1.120 1（r=0.999 2）。結果表明，甘露醇質量濃度在0.105～1.05 mg/ mL 范圍內其對數值與峰面積對數值線性關系良好。

定量限與檢測限考察：精密量取質量濃度為0.5 mg/ mL 的對照品溶液，逐級稀釋并進樣測定。取信噪比（S/N）約為10∶1，3∶1 時的待測成分質量濃度作為定量限和檢測限，結果分別為0.70 μg/ mL 和0.21 μg/mL。

精密度試驗：取2.2 項下對照品溶液（質量濃度為0.5 mg/mL），按2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果甘露醇峰面積的RSD為1.03%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取供試品溶液（批號為200611A）適量，按2.1 項下色譜條件，分別于0，4，8，12，16，24 h 進樣測定，記錄峰面積。結果甘露醇峰面積的RSD為1.21%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為200611A）適量，按2.2 項下方法平行制備6 份供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果甘露醇峰面積的RSD為1.32%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密移取樣品（批號為200611A）1 mL，置200 mL 容量瓶中，平行制備9 份，分成3 組，每組3份。每組分別加入甘露醇對照品70，50，30 mg，用流動相A 溶解并定容，搖勻，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測定

取3 批樣品適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以標準曲線法計算含量。結果批號為200611A，200204A，190405A 的樣品中甘露醇含量分別為50.71，50.62，50.21 mg/mL。

3 討論

3.1 檢測器選擇及優化

甘露醇的含量測定多采用高效液相色譜-示差折光檢測器（HPLC -RID）法［6］、高效液相色譜-蒸發光散射檢測器（HPLC -ELSD）法［7］、離子色譜法［13］等。RID檢測器對壓力和溫濕度的變化敏感，靈敏度低，且不能兼容梯度洗脫；ELSD檢測器靈敏度比RID檢測器高，對溫度變化不敏感，可用于梯度洗脫，但重現性較差；而離子色譜儀器昂貴，普及性不如液相色譜，且其中使用的氫氧化鈉（鉀）可能導致糖類異構化和分解［14-15］。CAD檢測器對化合物的結構無特定要求，適用于梯度洗脫，靈敏度、穩定性和重現性均具有明顯優勢［16］。

過濾常數分別考察了1.0，3.6，5.0，10.0，當設為1.0 時，甘露醇峰分叉，設為10.0 時，峰形明顯展寬，理論板數下降，故選擇3.6；采集頻率考察了5，10，25 Hz，色譜峰均無明顯差異；試驗中發現，冪函數增大，峰面積明顯下降，但對檢測結果的影響在2%范圍內，考慮過高的冪函數可能會在接近動態范圍下限的響應中產生或夸大“衰減”［14］，最終冪函數設為1.0；蒸發管溫度考察了35 ℃和50 ℃，當溫度為50 ℃時，峰面積下降10%，靈敏度較35 ℃差，故選擇35 ℃。

3.2 色譜條件優化

色譜柱：甘露醇測定常用的色譜柱有強陽離子鈣型交換柱、氨基柱、C18柱等，甲鈷胺則常用C18柱、氨基柱和氰基柱。強陽離子鈣型交換柱使用時柱溫要求較高（70～80 ℃），價格昂貴且耐用性差；氨基柱的耐用性亦較C18柱差，填料易塌陷，使用過程中柱壓逐漸升高，對甘露醇及甲鈷胺的吸附均大于C18柱，分析時間長。本試驗中選擇常規C18色譜柱進行分析。考察了Agilent ZORBAX SB -C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Phenomenex Luna C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）和Waters Symmetry C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），結果色譜峰形均較好。

流動相：考察流動相中乙腈不同比例對分離的影響，隨著乙腈比例升高，甘露醇峰形展寬，在80%乙腈條件下，甘露醇峰出現肩峰，故選擇乙腈比例較低的流動相；而低比例有機相對甲鈷胺洗脫能力差，在15%乙腈條件下，甲鈷胺保留時間超過40 min，故最終確定梯度洗脫，以保證甘露醇峰形良好并縮短分析時間。

流速與柱溫：當流速為1.0 mL/ min 時，甘露醇保留時間過短，受溶劑峰干擾，故選擇0.5 mL/min；不同柱溫（30，35，40 ℃）對分離及峰形無明顯影響。

3.3 線性回歸方式選擇

本研究中目標物進樣質量濃度約為0.5 mg/ mL，在0.1～1.0 mg/mL 范圍內，以甘露醇質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行回歸時，得相關系數為0.994，而分別取對數后進行回歸，相關系數為0.999 2。參考2020 年版《中國藥典（四部）》，確定經對數轉換后進行回歸。

3.4 方法評價

本研究中建立了測定甲鈷胺注射液中甘露醇含量的HPLC-CAD法，該方法簡單靈敏，準確度高，耐用性好，可用于甲鈷胺注射液的質量控制。甘露醇為重要藥用輔料，除傳統化學藥外，也廣泛用于生物大分子藥物，本研究中所建立的方法也可為其中甘露醇含量測定提供參考。