喬松素對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞焦亡的預(yù)防作用及其機制

張威，盧小偉，許浩

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國藥東風(fēng)總醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北十堰 442008

心血管疾病是全球病死率最高的疾病，占世界總死亡率的1/3，急性心肌梗死（AMI）是其中較為嚴(yán)重的一種心血管系統(tǒng)疾病［1］。臨床治療AMI的常用方法為再灌注，以此來改善心肌缺血的癥狀［2］。但心肌缺血改善后，可能會出現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷（MIRI），表現(xiàn)為心肌組織損傷或心功能異常。MIRI的發(fā)作機制主要與氧化應(yīng)激、炎癥、鈣超載、細(xì)胞因子釋放與中性粒細(xì)胞浸潤等密切相關(guān)［3］。細(xì)胞焦亡是一種新型的細(xì)胞程序性死亡形式，但其對炎癥具有促進(jìn)作用，并與NLRP3的激活相關(guān)。研究［4］表明，細(xì)胞焦亡與MIRI有一定關(guān)系。喬松素（PIN）是從某些植物、蜂膠或蜂蜜中提取出來的黃酮類化合物，藥理學(xué)研究顯示PIN 具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌和神經(jīng)保護(hù)等作用。研究［5］發(fā)現(xiàn)，PIN能夠使大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞引起的血管收縮能力減弱，發(fā)揮舒張血管的作用。也有證據(jù)顯示PIN 能改善缺血性心力衰竭大鼠的心律失常［6］。但是PIN 能否抑制缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡，目前還未明確。PI3K/AKT/NF-κB 是涉及炎癥的一種常見信號通路，LIU等［7］發(fā)現(xiàn)，葵潔元湯通過影響TLR4依賴性PI3K/AKT/NF-κB 氧化和炎癥信號及腸道微生物改善潰瘍性結(jié)腸炎的腸屏障損傷，但是該通路在H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡中的機制還尚不明確。2022年7月—2022年9月，本研究通過觀察預(yù)先加入PIN的大鼠心肌細(xì)胞H9c2 H/R 處理后的細(xì)胞活力、細(xì)胞焦亡情況、LDH 水平、細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)量變化，以探討PIN 對H/R 誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞焦亡的預(yù)防作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑及儀器 大鼠心肌細(xì)胞H9c2由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。大鼠心肌細(xì)胞H9c2 培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，在溫度37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 天更換一次培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長至80%左右進(jìn)行傳代，傳代3 次后的對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。喬松素（＞99%）購自于武漢科斯坦生物科技有限公司；高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco 公司（美國）；青霉素-鏈霉素混合液、CCK-8 試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PI、Hoechst 33342、BCA 蛋白定量試劑盒、PI3K、AKT、NF-κB、p-PI3K、p-AKT、p-NF-κB p65、Caspase-1、ASC、NLRP3 一抗及其相應(yīng)二抗購自Sigma 公司（美國）；PI3K 激活劑740-Y-P 購自Selleck 公司。儀器：全自動酶標(biāo)儀（F.A.M.E.16/20 型）購自瑞士哈美頓公司；全自動化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司；熒光顯微鏡購自德國Leica 公司；熒光定量PCR儀購自北京安諾倫生物科技有限公司。

1.2 H9c2 細(xì)胞分組、PIN 的加入、H/R 處理、將H9c2 細(xì)胞隨機分為PIN-H + 740-Y-P 組（25 μmol/L PIN + 50 μg/mL 740-Y-P［8］）、PIN-H 組（25 μmol/L PIN［9］）、PIN-L 組（12.5 μmol/L PIN）、模型組、對照組。對照組細(xì)胞的培養(yǎng)條件如1.1所述。其余各組細(xì)胞加入相應(yīng)濃度的藥物共同孵育1 h，之后進(jìn)行H/R處理。根據(jù)參考文獻(xiàn)［10］，首先對細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行處理。取無糖無血清的DMEM 培養(yǎng)基，將其置于37 ℃的低氧培養(yǎng)箱中，混合通入流速為2 L/min的95%N2和5%CO2氣體3 h。之后將H9c2細(xì)胞原有的培養(yǎng)基迅速換成上述處理好的DMEM 培養(yǎng)基，并放在低氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h。之后重新將培養(yǎng)基置換為含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基，在溫度37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

1.3 H9c2 細(xì)胞的活力檢測 采用CCK-8 法。將1.2 所述的各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后每孔中加入10 μL CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后，在酶標(biāo)儀450 nm下測定每孔的吸光度（OD450值）。

1.4 各組焦亡心肌細(xì)胞的比例測算 采用PI 染色法。將1.2 所述的各組細(xì)胞的培養(yǎng)基棄去，加入細(xì)胞染色緩沖液0.1 mL，加入Hoechst 染色液和PI 染色液各5 μL，輕輕晃勻，在4 ℃環(huán)境下避光孵育0.5 h。孵育結(jié)束后用PBS 洗滌，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色結(jié)果。Hoechst 染色結(jié)果陽性細(xì)胞呈藍(lán)色，PI 染色陽性細(xì)胞呈紅色。PI 陽性表示細(xì)胞出現(xiàn)焦亡。結(jié)果用PI陽性細(xì)胞比例表示。

1.5 各組H9c2 細(xì)胞中LDH 檢測 采用ELISA 法。將1.2 所述的各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，離心后取上清液。按照LDH試劑盒的說明書操作，測定H9c2細(xì)胞中的LDH。

1.6 各組H9c2 細(xì)胞中PI3K/AKT/NF-κB 信號通路和細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白檢測 采用Western blotting 法檢測。取1.2 所述的各組細(xì)胞，加入RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。配制分離膠和濃縮膠，上樣后電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉。加入PI3K、AKT、NF-κB p65、p-PI3K、p-AKT、p-NF-κB p65、Caspase-1、NLRP3、ASC、β-actin 一抗孵育過夜（4 ℃）。次日加入相應(yīng)二抗室溫下孵育1 h，進(jìn)行顯色、拍照和蛋白條帶灰度值的測定。

1.7 各組H9c2 細(xì)胞中PI3K、AKT 和NF-κB mRNA檢測 采用熒光定量PCR 法。取1.2所述的各組細(xì)胞，加入TRIzol 試劑提取細(xì)胞RNA，通過紫外分光光度法對RNA 進(jìn)行定量測定。將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min→94 ℃變性30 s→60 ℃退火30 s→72 ℃延伸30 s，共30 次循環(huán)。引物序列設(shè)計如下：PI3K上游引物：5′CATCACTTCCTCCTGCTCTAT3′，下游引物：5′CAGTTGGTTGGCAATCTTCTTC3′；AKT 上游引物：5′AAACCTGGCGGCCACGCTAC3′，下游引物：5′TTGGCCAGGGCCACCTCCAT3′；NF-κB 上游引物：5′CAAGATCTGCCGAGTAAACC3′，下游引物：5′TCGGAACACAATGGCCACTT3′；β-actin 上游引物：5′GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA3′，下游引物：5′ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG3′。以β-actin 為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt方法計算PI3K、AKT 和NF-κB mRNA的相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad 7.0 軟件。正態(tài)分布檢驗采用Shapiro-Wilk 法，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組H9c2 細(xì)胞活力比較 與對照組相比，模型組細(xì)胞OD450值（48 h、72 h）降低（P均＜0.05）；與模型組相比，PIN-H 組細(xì)胞OD450值（48 h、72 h）升高（P均＜0.05）；與PIN-L組相比，PIN-H組細(xì)胞OD450值（48 h、72 h）升高（P均＜0.05）；與PIN-H 組相比，PIN-H + 740-Y-P 組細(xì)胞OD450值（48 h、72 h）降低（P均＜0.05），詳見表1。

表1 各組大鼠H9c2細(xì)胞活力比較（±s）

表1 各組大鼠H9c2細(xì)胞活力比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與PIN-L組比較，^P＜0.05；與PIN-H組組比較，&P＜0.05。

組別OD450值72 h 0.57 ± 0.05^0.71 ± 0.05#&0.52 ± 0.06 0.47 ± 0.04*0.84 ± 0.07 PIN-H + 740-Y-P組PIN-H組PIN-L組模型組對照組24 h 0.30 ± 0.03 0.28 ± 0.04 0.26 ± 0.03 0.24 ± 0.02 0.27 ± 0.03 48 h 0.38 ± 0.03^0.54 ± 0.04#&0.40 ± 0.05 0.35 ± 0.04*0.62 ± 0.05

2.2 各組PI 陽性心肌細(xì)胞比例、LDH 水平、細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較 與對照組相比，模型組PI 陽性心肌細(xì)胞比例，LDH 水平，Caspase-1、ASC和NLRP3蛋白相對表達(dá)量升高（P均＜0.05）；與模型組相比，PIN-H 組PI 陽性心肌細(xì)胞比例，LDH 水平，Caspase-1、ASC 和NLRP3 蛋白相對表達(dá)量降低（P均＜0.05）；與PIN-L 組相比，PIN-H 組PI 陽性心肌細(xì)胞比例，LDH 水平，Caspase-1、ASC 和NLRP3 蛋白相對表達(dá)量降低（P均＜0.05）；與PIN-H 組相比，PIN-H+ 740-Y-P 組PI 陽性心肌細(xì)胞比例，LDH 水平，Caspase-1、ASC 和NLRP3 蛋白相對表達(dá)量升高（P均＜0.05），詳見表2。

表2 各組PI陽性心肌細(xì)胞比例、LDH水平及細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較（±s）

表2 各組PI陽性心肌細(xì)胞比例、LDH水平及細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與PIN-L組比較，^P＜0.05；與PIN-H組組比較，&P＜0.05。

組別PIN-H + 740-Y-P組PIN-H組PIN-L組模型組對照組NLRP3 0.56 ± 0.06^0.41 ± 0.05#&0.62 ± 0.08 0.65 ± 0.06*0.36 ± 0.04 PI陽性心肌細(xì)胞比例（%）47.20 ± 5.06^31.42 ± 4.55#&50.48 ± 8.21 59.23 ± 6.16*5.47 ± 0.94 LDH（U/L）114.83 ± 8.23^71.46 ± 6.50#&130.54 ± 15.49 143.63 ± 10.91*23.48 ± 2.04 Caspase-1 0.56 ± 0.05^0.44 ± 0.05#&0.63 ± 0.08 0.69 ± 0.06*0.33 ± 0.04 ASC 0.47 ± 0.05^0.38 ± 0.04#&0.51 ± 0.07 0.54 ± 0.05*0.24 ± 0.03

2.3 各組細(xì)胞中PI3K/AKT/NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白及PI3K、AKT 和NF-κB mRNA 表達(dá)的比較 與對照組相比，模型組細(xì)胞中PI3K、AKT 和NFκB mRNA 相對表達(dá)量及PI3K、AKT 和NF-κB p65 蛋白磷酸化水平升高（P均＜0.05）；與模型組比較，PIN-H 組細(xì)胞中PI3K、AKT 和NF-κB mRNA 相對表達(dá)量及PI3K、AKT 和NF-κB p65 蛋白磷酸化水平降低（P＜0.05）；與PIN-L 組相比，PIN-H 組細(xì)胞中PI3K、AKT 和NF-κB mRNA 相對表達(dá)量及PI3K、AKT 和NF-κB p65 蛋白磷酸化水平降低（P＜0.05）；與PIN-H 組相比，PIN-H + 740-Y-P 組細(xì)胞中PI3K、AKT 和NF-κB mRNA 相對表達(dá)量及PI3K、AKT 和NF-κB p65 蛋白磷酸化水平升高（P均＜0.05），詳見表3。

表3 各組細(xì)胞中PI3K、AKT和NF-κB mRNA相對表達(dá)量及PI3K、AKT和NF-κB p65蛋白磷酸化水平比較（±s）

表3 各組細(xì)胞中PI3K、AKT和NF-κB mRNA相對表達(dá)量及PI3K、AKT和NF-κB p65蛋白磷酸化水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與PIN-L組比較，^P＜0.05；與PIN-H組比較，&P＜0.05。

組別PIN-H + 740-Y-P組PIN-H組PIN-L組模型組對照組p-NF-κB p65/NFκB p65 0.64 ± 0.07^0.51 ± 0.05#&0.72 ± 0.09 0.76 ± 0.08*0.40 ± 0.05 PI3K mRNA 1.69 ± 0.02^1.32 ± 0.01#&1.83 ± 0.04 1.86 ± 0.02*1.00 ± 0.00 AKT mRNA 1.66 ± 0.03^1.46 ± 0.02#&1.74 ± 0.05 1.78 ± 0.02*1.00 ± 0.00 NF-κB mRNA 1.52 ± 0.02^1.37 ± 0.03#&1.61 ± 0.05 1.65 ± 0.04*1.00 ± 0.00 p-PI3K/PI3K 0.70 ± 0.07^0.54 ± 0.05#&0.78 ± 0.08 0.81 ± 0.06*0.44 ± 0.05 p-Akt/Akt 0.77 ± 0.08^0.59 ± 0.06#&0.81 ± 0.10 0.85 ± 0.09*0.56 ± 0.06

3 討論

MIRI 是心血管疾病中常見的組織損傷，它是缺血的心肌組織灌注血液后出現(xiàn)心率失常、心肌能量代謝障礙、甚至出現(xiàn)梗死面積擴(kuò)大等不良現(xiàn)象［11］。目前針對MIRI 并無特效藥，其嚴(yán)重影響了AMI 的治療效果，為臨床治療帶來阻礙和困難。H9c2 細(xì)胞能完整復(fù)制成年大鼠的心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)和電生理學(xué)等生理學(xué)特征，且H9c2 的H/R 損傷能與人體心肌細(xì)胞MIRI 的病理學(xué)特征與機制契合。如今使用H9c2 細(xì)胞構(gòu)建大鼠心肌細(xì)胞H/R 模型已被廣泛熟知與應(yīng)用［12-13］。有證據(jù)表明當(dāng)H/R 發(fā)生時，心肌細(xì)胞膜通透性增加，心肌中LDH 大量釋放入血，使血清中LDH 水平升高［14］。本研究結(jié)果顯示，模型組H9c2 細(xì)胞活力下降；細(xì)胞焦亡比例、LDH 水平升高，說明大鼠心肌細(xì)胞H/R 模型建立成功。

細(xì)胞焦亡是一種促炎性、程序性的細(xì)胞死亡方式。細(xì)菌、病毒、毒素或化療藥物等作為細(xì)胞損傷的誘因，通過Caspase-1 蛋白介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生。當(dāng)細(xì)胞焦亡發(fā)生時，細(xì)胞質(zhì)膜破裂，內(nèi)容物流出，促炎因子釋放［15-16］。細(xì)胞焦亡在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病如心肌MIRI 和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［17-18］。研究［19］發(fā)現(xiàn)，MIRI 發(fā)生時細(xì)胞焦亡引起的炎癥損傷會使病情加重，抑制細(xì)胞焦亡可以有效減輕MIRI 的心肌損傷。BIAN 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組小鼠心肌梗死面積和LDH水平增加，焦亡相關(guān)蛋白GSDMD-NT 和Caspase-1水平增加。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組心肌細(xì)胞焦亡比例，血清LDH 水平，細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白Caspase-1、ASC 和NLRP3 的表達(dá)升高，與文獻(xiàn)報道相一致。說明心肌細(xì)胞的H/R 模型造模成功。

PIN 存在于多種植物、蜂膠中，這種黃酮類單體化合物對很多疾病均有治療作用。TAO 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，PIN 能保護(hù)缺血/再灌注引起的腦損傷，機制可能與細(xì)胞自噬有關(guān)。艾世鵬等［22］研究發(fā)現(xiàn)，PIN能夠保護(hù)腸缺血/再灌注的腸黏膜損傷，這種作用可能與其抗炎、抗氧化和抑制p38 MAPK 信號通路活性有關(guān)。于飛等［23］研究發(fā)現(xiàn)，PIN 能減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，其機制可能與抑制ATF6/PERKCHOP 信號通路有關(guān)。這些結(jié)果都提示PIN可能通過發(fā)揮其抗炎作用來減輕H/R心肌細(xì)胞的損傷。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，PIN-H 組細(xì)胞活力（48 h、72 h）提高，心肌細(xì)胞焦亡比例，LDH 水平，焦亡相關(guān)蛋白Caspase-1、ASC 和NLRP3 表達(dá)降低，說明PIN 能預(yù)防H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡。

PI3K/AKT/NF-κB 信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、凋亡和血管生成的重要信號通路之一，它能減輕炎癥和損傷［24］。越來越多研究者發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT/NF-κB 信號通路在調(diào)節(jié)H/R 中發(fā)揮重要作用。LUAN 等［25］發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT，抑制NF-κB 信號傳導(dǎo)來減輕心肌H/R 損傷，減輕炎癥和抑制凋亡。DONG 等［26］研究發(fā)現(xiàn)，囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)劑的過表達(dá)能保護(hù)人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞免受H/R 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，可能是通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/NF-κB 信號通路實現(xiàn)的。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組心肌細(xì)胞PI3K、Akt 和NFκB mRNA 相對表達(dá)量，PI3K、Akt、NF-κB p65蛋白的磷酸化水平上升；與模型組相比，PIN-H 組心肌細(xì)胞PI3K、Akt 和NF-κB mRNA 相對表達(dá)量，PI3K、Akt、NF-κB p65 蛋白的磷酸化水平下降。這些結(jié)果說明PIN 可能通過抑制PI3K/AKT/NF-κB 信號通路，抑制H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡。為了驗證此猜想，我們用PI3K 激活劑740-Y-P 來干預(yù)高濃度的PIN 組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)740-Y-P 減弱了PIN 對心肌細(xì)胞焦亡的抑制作用。

綜上所述，PIN可能通過下調(diào)PI3K/AKT/NF-κB信號通路，預(yù)防H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡。該研究為MIRI 臨床治療方法及其機制提供了新的思路。但本研究是在細(xì)胞水平上進(jìn)行的研究，為探索其在體內(nèi)作用的影響與機制，還需進(jìn)一步設(shè)計相關(guān)動物試驗及臨床試驗。