中醫(yī)藥抑制腦出血后鐵死亡的研究進展*

王天琪,鄒偉

1.黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040

腦出血指非外傷性腦實質內出血,是腦卒中的一個亞型,以老年患者居多。腦出血具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點,給社會和患者家庭帶來了沉重的負擔[1]。在全球范圍內,每年新發(fā)腦出血病例約200萬,且呈逐年上升的趨勢,預計2050年該病的發(fā)病率將翻倍[2]。雖然腦出血的發(fā)病率僅占腦卒中疾病的26.7%～51.5%,但它比腦梗死的預后更為嚴重,多數患者受到不同程度的殘疾的困擾,且該病30天內的死亡率高達20%～40%[3]。腦出血后,除血腫機械占位等原發(fā)損傷外,血腫周圍出現的腦水腫、缺血缺氧等繼發(fā)性損傷亦是影響患者長期預后的主要因素。目前,西醫(yī)療法雖見效快,但仍存在手術導致的再出血、感染、神經損傷等風險。中醫(yī)藥具有多途徑、多靶點的優(yōu)勢,體內、體外實驗均已證實其在治療疑難雜癥方面的獨特作用。近年來,鐵死亡作為一種新型細胞死亡形式受到了醫(yī)學領域的廣泛關注。中醫(yī)藥能夠通過干預鐵死亡核心分子的上下游環(huán)節(jié)實現對受損神經細胞空間構象與功能障礙的調節(jié)。現有研究圍繞腦出血后神經細胞出現的鐵沉積、氧化應激、內質網應激、線粒體功能障礙等開展了大量中醫(yī)藥抗鐵死亡的作用機制研究[4-5],中醫(yī)藥調節(jié)鐵死亡已成為腦出血治療的新方向。本文以鐵死亡為切入口,簡述其發(fā)生機制及中醫(yī)藥對腦出血后鐵死亡的干預機制,以期為進一步提高中醫(yī)藥治療腦出血的療效提供思路。

1 鐵死亡概述

鐵死亡的概念于10年前由Dixon等[6]提出,是因細胞內鐵過載而發(fā)生的一種新型程序性細胞死亡方式,主要損害細胞的抗氧化能力,使得脂質過氧化從而導致死亡。鐵死亡與壞死、凋亡等其他細胞死亡形式在細胞形態(tài)、生化特征、遺傳特征方面存在顯著差異[6]:在細胞形態(tài)上,主要表現為線粒體體積縮小、膜密度增大、嵴減少或消失、密度增大、外膜破裂,但細胞核正常[7];在生化特征上,表現為細胞內具有抗氧化作用的谷胱甘肽合成減少或耗竭[6],致使過氧化物分解酶谷胱甘肽過氧化物酶4活性下降甚至失活,影響氧化還原反應,病理性鐵積累可通過芬頓反應產生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),與細胞膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化應激反應,促進毒性脂質過氧化物的聚積,誘導細胞氧化性損傷,導致細胞鐵死亡[8];在遺傳特征上,鐵死亡是由鐵代謝、脂質合成和氧化應激途徑相關的基因調控的生物學過程[9]。

2 鐵死亡的發(fā)生機制

鐵死亡的發(fā)生與細胞內脂質過氧化和鐵代謝紊亂有關,下文將就這兩方面簡要歸納鐵死亡的發(fā)生發(fā)展以及腦出血發(fā)生后的主要變化。

2.1 脂質過氧化脂質過氧化的發(fā)生主要是因為磷脂膜上含有易受過氧化作用影響的碳原子的脂質,如多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA),在相鄰的C=C雙鍵之間存在異常弱的 C-H 鍵,過氧基(O-O)取代附著在碳原子上的氫原子,最終導致細胞鐵死亡[10]。PUFA特別是含有花生四烯酸(arachidonic acid,AA)或其衍生物腎上腺素的磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)[11]的脂質過氧化驅動細胞走向鐵死亡,酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員4(acyl-CoA ligase 4,ACSL4)和溶血磷脂酰膽堿酰基轉移酶3(lysophosphatidylcholine acyltransferase 3,LPCAT3)參與 PE的生物合成和重塑,能催化PUFA酯化,激活PUFA,并影響PUFA的跨膜特性,進而增加細胞鐵死亡敏感性,隨后在脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)的催化下進一步氧化生成對鐵死亡具有促進作用的多不飽和脂肪酸磷脂氫過氧化物(PUFA-PL-OOH)[10]。目前,在人類和小鼠腦出血后均可觀察到LOX和脂質過氧化物的增加[12]。廣泛的脂質過氧化及PUFA耗竭的惡性連鎖反應改變了細胞膜的穩(wěn)定性,具有毒性的脂質過氧化物引起蛋白質等分子失活是鐵死亡的直接驅動因素。

system Xc-/GSH/GPX4所在的通路被看作是鐵死亡脂質過氧化級聯(lián)反應中的上游事件[13],是細胞內重要的抗氧化系統(tǒng)。system Xc-是細胞膜上的胱氨酸/谷氨酸逆向轉運體,由兩個亞基SLC7A11、SLC3A2組成,可介導細胞內外谷氨酸與胱氨酸進行11交換[14],胱氨酸進入細胞后被還原為半胱氨酸(cysteine,Cys),與谷氨酸共同用于合成谷胱甘肽(glutathione,GSH)。GSH是一種具有清除氧自由基作用的抗氧化劑,由甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸構成[15]。谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione Peroxidase 4,GPX4)是谷胱甘肽過氧化物酶家族的一位重要成員,在自由基和重金屬的刺激下,在GSH作為輔酶的作用下可將具有活性的PUFA-PL-OOH還原為不具有活性和致命性的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)[10],從而抑制細胞鐵死亡。由此可見,當system Xc-被抑制后,細胞內GSH合成減少,GPX4活性降低,脂質過氧化物PUFA-PL-OOH大量累積,為細胞發(fā)生鐵死亡創(chuàng)造了物質基礎。除此之外,在過去的幾年里,已經發(fā)現了3種獨立于system Xc-/GSH/GPX4的抑制鐵死亡的系統(tǒng)。鐵死亡抑制蛋白1(ferroptosis suppressor protein 1,FSP1)/輔酶Q10(CoQ10)、二氫乳清酸脫氫酶(dihydroorotate dehydrogenases,DHODH)、GTP環(huán)化水解酶1(GTP cyclohydrolase 1,Gch1)/四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)均可對鐵死亡中脂質過氧化物積累過程進行調節(jié)[10]。

腦出血后,神經細胞外谷氨酸表達水平明顯升高,system Xc-對細胞外谷氨酸的濃度異常敏感,使得其轉運谷氨酸的作用明顯受限,胞內谷氨酸攝取減少,GSH合成受抑制,細胞抗氧化防御受到影響,造成脂質活性氧積累而引發(fā)鐵死亡[16]。Zhang等[17]發(fā)現大鼠在腦出血后的24 h,腦內GPX4達到最低水平,并檢測出GPX4下降主要發(fā)生在神經細胞中,此時神經細胞的抗氧化能力已明顯降低。現有證據表明,鐵螯合劑可顯著改善腦出血小鼠的腦損傷[17],并對腦出血后繼發(fā)性出血有抑制作用,進一步證實了鐵死亡在腦出血后繼發(fā)性神經細胞損傷中的潛在調節(jié)作用。同時,谷氨酸亦具有神經遞質作用,谷氨酸水平過高會導致谷氨酸受體過度刺激,導致興奮性毒性和神經細胞死亡。另外,谷氨酸的濃度還與腦出血的殘腔體積和不良的神經功能有關。因此,如何降低細胞外谷氨酸的積累、調節(jié)谷氨酸代謝以及提高細胞內的抗氧化能力是減輕鐵死亡的又一關鍵環(huán)節(jié)。

2.2 鐵代謝細胞鐵代謝是一個復雜過程,胞內鐵含量的變化依賴于鐵的吸收、排泄、利用和儲存之間的動態(tài)平衡,鐵代謝紊亂會影響其他代謝過程進而導致疾病的發(fā)生。生理狀態(tài)下,細胞外Fe3+可以直接與轉鐵蛋白(transferrin,TF)以21的比例結合,而Fe2+必須氧化成Fe3+才能與TF結合[18],細胞膜上的轉鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1,TFR1)對含Fe3+的TF具有較高的親和力,Fe3+、TF、TFR1三者結合后以胞吞形式入胞[19],隨后金屬還原酶3將Fe3+還原為Fe2+,然后在二價金屬離子轉運體和鋅-鐵調節(jié)蛋白家族8/14(ZIP8/14)的作用下,脫蛋白被釋放至胞質中[20],儲存在不穩(wěn)定鐵池(labile iron pool,LIP)內,或被氧化成Fe3+儲存于鐵蛋白中,以防Fe2+引起氧化應激,避免細胞損傷或死亡[21-22]。當鐵穩(wěn)態(tài)失衡時,過量的Fe2+可催化芬頓反應,產生具有較強毒性的羥基自由基,并與磷脂細胞膜上的PUFA共同啟動脂質過氧化鏈式反應,使細胞內脂質活性氧濃度增加,對胞膜的完整性、穩(wěn)定性造成威脅[23-24],誘導鐵死亡。

線粒體鐵蛋白(mitochondrial ferritin,FtMt)是一種線粒體鐵儲存蛋白,其表達具有組織特異性,在代謝活動度高的細胞中呈現高表達,如睪丸、大腦等[25]。研究發(fā)現,FtMt主要表達于神經元,而非膠質細胞[26]。此外,FtMt可以調節(jié)異常的鐵代謝,從而減少ROS的產生和積累,顯著抑制鐵死亡的發(fā)生[27]。

鐵自噬由Mancias等[28]于2014年首次提出,是一種通過溶酶體降解鐵蛋白釋放游離鐵來調控細胞內鐵含量的選擇性自噬方式。適度鐵自噬可以幫助細胞保持鐵含量穩(wěn)定,但是過度的鐵自噬使溶酶體受損,釋放出大量游離鐵并在芬頓反應下產生大量的ROS,誘導脂質過氧化,使細胞發(fā)生鐵死亡[29]。在缺鐵條件下,核受體共激活因子4結合鐵蛋白將其遞送至自噬體內,在自噬體中,鐵蛋白經溶酶體降解后,鐵被釋放并輸出至細胞質增加LIP,進而催化芬頓反應,導致ROS積累,促進鐵死亡[30]。

腦出血發(fā)生后,紅細胞破裂,產生大量血紅蛋白,血紅蛋白分解產生含鐵血紅素和珠蛋白,其中的含鐵血紅素通過與血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)反應,進一步裂解生成游離鐵,進而使出血部位Fe2+積累,通過參與炎癥反應誘導氧化應激和芬頓反應,促進lipid-ROS生成,破壞了細胞氧化平衡,導致鐵死亡發(fā)生[31]。此外,Fe2+通過催化芬頓反應生成的水會直接加重出血部位水腫;而生成的羥基自由基會攻擊腦細胞膜磷脂中的多聚不飽和脂肪酸,發(fā)生脂質過氧化反應,導致機體Ca2+-Mg2+-ATP酶等失活,進而造成離子運轉障礙,導致血腦屏障結構受損,血管通透性增加而加重出血部位水腫[32]。然而又有研究指出,HO-1在鐵代謝中既是鐵死亡的抑制劑又是促進劑[33],一方面,當ROS被清除時,HO-1被中度激活,通過降解游離鐵和膽綠素發(fā)揮細胞保護作用,防止細胞衰老;另一方面,當HO-1被高度激活時,通過積累更多的鐵和產生更多的ROS發(fā)揮促氧化作用,從而加速鐵死亡的進程。因此,鐵過載誘導的鐵死亡以及后續(xù)發(fā)生的抗氧化劑消耗,可能也是腦出血后腦損傷的一個重要機制。

3 中醫(yī)藥抑制腦出血后鐵死亡研究現狀

目前,中醫(yī)藥已廣泛應用于腦出血治療全程。通過分析腦出血的病因病機,探究鐵死亡典型特征所蘊含的中醫(yī)學內涵,構建神經細胞鐵死亡與腦出血病因病機的內在關聯(lián),更有利于探究中醫(yī)藥精準干預腦出血后的鐵死亡環(huán)節(jié)。

3.1 從中醫(yī)病機理論探討腦出血后鐵死亡的機制腦出血可歸屬于中醫(yī)“中風中臟腑閉證陽閉”范疇,其中醫(yī)核心證候要素為“虛、瘀、痰”。中醫(yī)理論認為“氣血逆亂,上犯于腦”是其病機,本病的證候特征是血溢腦脈之外所引起的腦髓神機受損[34-35]。從中醫(yī)角度分析鐵死亡特征可知,過量的鐵與脂質過氧化物沉積均為聚集于腦之脈絡的瘀濁實邪。瘀濁附于腦之絡脈阻礙氣血正常運行,腦絡因實邪阻滯出現氣滯血瘀或因氣血不榮而致因虛致瘀,瘀阻津停,津聚成痰,痰瘀互結,郁而化熱,釀生痰熱,熱傷陰津,更可加重人體陰陽失衡狀態(tài),虛、熱、痰均可致風,諸邪交織,互為因果。腦出血早期可觀察到的 ROS與腦鐵沉積均為瘀濁滯絡的表現,此為神經細胞處于損傷的初始階段。隨著病情發(fā)展,病理產物大量蓄積,在鐵的催化下驅動了鏈式脂質過氧化反應,產生了具有毒性的脂質過氧化產物,則為邪蘊成毒的表現。腦出血患者以虛為本,濁毒久郁,虛實兼夾而致髓虛毒損,加劇臟腑衰憊。因此,基于腦出血病機分析鐵死亡的中醫(yī)學內涵對中醫(yī)藥調節(jié)鐵死亡具有重要意義,毒性代謝產物對神經系統(tǒng)的致死性作用與瘀濁實邪對腦絡、腦髓的損傷機理存在共通性。在日后研究中,可深入挖掘以瘀、痰、濕、毒為代表的瘀濁實邪的生物學基礎,為中醫(yī)藥調節(jié)腦出血后鐵死亡提供證據。

3.2 中醫(yī)藥治療腦出血后鐵死亡近年來,中醫(yī)藥對腦出血后鐵死亡的調控機制成為研究熱點,學者們致力于運用中醫(yī)藥療法對抗機體的脂質過氧化損傷,糾正鐵代謝紊亂,從而抑制細胞鐵死亡的發(fā)生發(fā)展,為中醫(yī)藥治療腦出血后鐵死亡奠定堅實基礎。

3.2.1 針對脂質過氧化的治療Jin等[36]通過體內及體外實驗探究了中藥提取物丹皮酚對腦出血后鐵死亡的作用,發(fā)現丹皮酚可通過HOTAIR/UPF1/ACSL4信號通路上調SLC7A11和GPX4的表達,下調ACSL4的表達,降低神經元中ROS和脂質過氧化物MDA的含量,從而達到抑制神經元鐵死亡的目的,保護受損腦組織。Yang等[37]觀察中藥姜黃提取物——姜黃素對小鼠腦出血的影響,結果表明姜黃素可通過調節(jié)NRF2/HO-1通路增加GPX4的表達從而控制細胞內脂質過氧化的進程,顯著抑制神經細胞的鐵死亡。Zhao等[38]研究表明,中藥提取物異鉤藤堿可通過抑制P53的表達,上調miR-122-5p的表達,促進SLC7A11的轉錄,從而促進GPX4的表達,降低脂質過氧化常見產物4-HNE的表達,發(fā)揮其抗腦出血后鐵死亡的作用。研究表明,針刺療法同樣可在腦出血后發(fā)揮抑制神經細胞鐵死亡的作用,實驗過程中觀察到針刺后腦出血大鼠腦組織中鐵死亡相關的線粒體形態(tài)損傷有所減輕,同時,細胞內MDA含量明顯減少,可見,針刺能夠在神經細胞鐵死亡脂質過氧化方面發(fā)揮積極作用,抑制鐵死亡的發(fā)生[39]。Kong等[40]研究發(fā)現,針刺療法可促進GPX4的表達,抑制腫瘤周圍區(qū)域的鐵含量增加,降低ROS及MDA的積累,表明針刺可減輕大鼠腦出血后血腫周圍區(qū)域的鐵死亡,抑制神經元損傷,進而促進神經功能恢復。有證據表明,在腦出血后,頭針治療可通過促進p62/Keap1/Nrf2抗氧化信號通路保護腦組織[41]。Nrf2是氧化應激背景下的關鍵調節(jié)劑,可作為抗氧化劑保護細胞免受鐵死亡[42]。Li等[43]探討了頭針療法能否通過緩解鐵死亡減輕小鼠腦出血后出現的繼發(fā)性損害,并探討了與該過程相關的病理生理機制,發(fā)現頭針治療能夠通過觸發(fā)抗氧化途徑 p62/Keap1/Nrf2,并引起GPX4和行使鐵蛋白功能的主要亞單位FTH1上調從而促進腦出血后恢復,減輕腦出血后脂質過氧化引起的神經細胞鐵死亡。另外,針刺也可以降低家兔腦出血組織脂質過氧化產物含量[44]。Wang等[45]研究了中藥藏紅花中的有效成分藏紅花素對腦出血小鼠的作用,結果表明藏紅花素可通過調節(jié)Nrf2的表達及核易位上調GPX4、SLC7A11和FTH1的表達,抑制腦出血后細胞內脂質過氧化的過程,最終降低細胞鐵死亡發(fā)生的概率,從而保護腦組織。Wang等[46]通過網絡藥理學和動物實驗相結合的方法證實蛭龍活血通瘀膠囊可以下調P53表達,促進SLC7A11表達,抑制細胞內脂質過氧化過程,最終抑制大鼠腦出血后鐵死亡。上述研究表明,中醫(yī)藥療法可通過調節(jié)對脂質過氧化有直接影響的代謝途徑抑制脂質過氧化,減輕細胞內毒性脂質ROS的積聚從而抑制鐵死亡。

3.2.2 針對鐵代謝異常的治療楊樹升等[47]研究了大承氣湯對腦出血大鼠的影響,結果顯示,高劑量大承氣湯能夠通過Nrf2介導的信號通路有效逆轉大鼠腦出血后神經功能受損,減少病灶處鐵沉積,促進抗炎性因子Arg1釋放,并抑制促炎性因子TNF-α釋放,從而促進腦出血后腦組織恢復,發(fā)揮神經保護作用。蔣士生等[48]構建腦出血大鼠模型觀察四妙勇安湯對腦組織內血紅素和鐵離子代謝的作用,結果表明,作為治療血管炎名方的四妙勇安湯可以通過調節(jié)毛細血管內皮細胞膜蛋白從而降低腦內游離血紅素和鐵離子含量,以保護神經元、促進神經功能恢復。郭純等[49]觀察了安腦平沖方對腦出血大鼠腦組織鐵沉積和病灶周圍組織轉鐵蛋白(Tf)及其受體的影響,實驗結果顯示該方能夠改善腦出血后神經功能受損及鐵沉積、Tf、TfR表達升高等不利局面,抑制鐵離子向神經細胞內大量轉移,減輕氧化應激損傷,從而改善腦出血的預后。研究指出,腦出血急性期大鼠模型病灶腦組織鐵沉積量逐漸升高,鐵沉積使細胞抗氧化分子GSH和GPX-4耗竭,lipid-ROS累積而誘發(fā)神經細胞鐵死亡,從而導致繼發(fā)性腦損傷[50]。黃芩苷是中藥黃芩的有效成分,研究發(fā)現,經黃芩苷干預后,腦出血小鼠神經細胞損傷程度顯著減輕,腦組織內鐵離子沉積減少,鐵死亡相關基因表達明顯改變,表明黃芩苷能夠抑制鐵死亡,減少神經細胞凋亡[51]。腦泰方可調節(jié)腦出血急性期神經細胞鐵轉運和調節(jié)蛋白的表達,提高神經細胞抗氧化分子的含量,從而減輕腦組織鐵沉積和神經細胞過氧化損傷,抑制神經細胞鐵死亡,發(fā)揮腦保護作用[50]。周玉嘉[52]通過臨床試驗及動物實驗證實,具有活血解毒功效的醒腦靜注射液能夠顯著改善腦出血火毒證患者氧化應激狀態(tài),促進患者神經功能恢復,同時改善腦出血大鼠神經功能損傷,調節(jié)腦出血后腦組織鐵離子代謝紊亂,抑制鐵死亡的發(fā)生。羅賢亮等[53]研究表明,消瘀通腑湯配合穴位針刺可顯著提高腦出血患者的臨床療效,改善神經功能缺損程度,提高日常活動能力,對腦組織有較好的保護作用,并可改善機體鐵代謝水平。此外,頭針治療能夠通過類似于鐵螯合劑的方式減少多余的鐵,防止脂質過氧化造成的傷害,從而抑制鐵死亡,減輕腦出血后神經功能缺損[54-55]。

上述研究表明,中醫(yī)藥療法不僅可以通過調控脂質過氧化過程抑制鐵死亡,還可以通過調節(jié)機體內鐵代謝、糾正離子紊亂、抑制鐵離子積聚、破壞Fenton反應物質基礎從而控制鐵死亡的進展。

4 討論

近年來,對中醫(yī)藥調控鐵死亡相關信號通路的研究取得了一定的進展,但基于腦出血的研究多局限于動物實驗,且多是單獨探索中醫(yī)藥療法對鐵死亡通路上某個關鍵靶點的影響,缺乏大規(guī)模、長期隨訪的臨床試驗驗證,與鐵死亡相關的作用機制研究匱乏,且細胞死亡方式相關信號通路及其交互影響有待探討。今后的研究應繼續(xù)梳理與總結鐵死亡相關信號傳導通路,探究腦出血病理過程中與鐵死亡相關的信號調節(jié)機制,進一步開展與腦出血后鐵死亡相關基因表達的鑒定,探索中醫(yī)藥調控鐵死亡的機制,挖掘傳統(tǒng)中藥單體活性成分、復方及針刺、艾灸、推拿等中醫(yī)適宜技術的關鍵靶點,為中醫(yī)藥治療腦出血提供新的思路與策略。