藏紅花總苷片的制備及質量標準的初步研究*

陳 雁，王光雨

(揚州市職業大學醫學院，江蘇 揚州 225200)

藏紅花總苷是一類以藏紅花素1為主的二萜類化合物[1]，具有廣泛而良好的藥理活性，對中樞神經系統和心血管系統疾病均具有良好的療效，同時，還具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、保肝利膽、抗糖尿病等作用[2]。許多傳統名貴方藥中均含有藏紅花苷類成分，如市場出售的西紅花總苷片。其具有活血化瘀、通脈、止痛等功效，是胸痹心痛、心血瘀阻患者的治病良藥。但由于以名貴稀缺藥材——藏紅花為原料藥材，藏紅花產量極低，價格非常昂貴，堪比黃金，因此，開采利用的成本極高。有研究表明，梔子藥材中也含有該類成分[3]，故本研究依據選用藏紅花的平價替代藥材——梔子進行了深度研究，不僅節約了成本，還為梔子的開發利用提供了依據。作者前期已開展了梔子藥材中藏紅花總苷成分的提取純化工藝研究[4]。現將從便于攜帶、藥物顯效迅速、提高藥物生物利用度等角度制成片劑，從輔料選擇、用量確定、濕法制粒、壓片、包衣等角度確定片劑制備工藝并進行質量研究，旨在為該類制劑的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器 UV-1200紫外可見分光光度計購自美國安捷倫公司，高效液相色譜儀購自美國安捷倫公司，AY120電子天平購自日本島津公司，ZP-9旋轉式壓片機購自上海天闔機械設備有限公司，GHL-10濕法混合制粒機購自長沙市岳麓區中南制藥機械廠，ZBJ-01智能崩解儀購自上海精勝科學儀器有限公司。

1.1.2實驗材料 藏紅花總苷為自制(批號分別為211203、211209、211214)，淀粉、糊精、硬脂酸鎂均購自河北省廊坊市淀粉廠，微晶纖維素購自上海昌為醫藥輔料技術有限公司，羧甲基淀粉鈉(CMS-Na)購自蘇州依俐法化工有限公司，滑石粉購自青島盛達源滑石粉開發有限公司，對照品為藏紅花素1及藏紅花酸標準品，均購自中國藥品生物制品檢定所(純度均在98%以上)，市售西紅花總苷片購自瑞陽制藥有限公司(國藥準字：Z20163079)。

1.2方法

1.2.1劑型選擇 在開發藏紅花總苷片方面遵循國際通行的能口服不注射的原則，藏紅花苷類化合物在水中溶解性較好，可選擇口服制劑。擬開發為片劑是由于藏紅花總苷具有一定苦味，制成片劑包衣對藥物有一定程度上的遮蔽、保護與穩定作用，實現了良藥不苦口、便于患者吞服等優勢；且片劑質量穩定，劑量準確，攜帶、運輸及貯藏均較為方便，成本相對低廉[5]。

1.2.2輔料篩選 藏紅花總苷原料為中藥浸膏，具有吸濕性，長期放置會出現硬結現象，這就要求選擇合適的輔料改善主藥的吸濕性質，使主藥干燥，從而保證制劑質量穩定[6]。

1.2.2.1潤濕劑選擇 由于藏紅花總苷中含有大量易溶于水的成分——藏紅花素1，在制備顆粒的過程中選用含水乙醇作為潤濕劑要充分考慮含水量，含水量不宜過高，以防藥粉粘結成塊，難以制粒。選擇60%、75%、90%乙醇做平行試驗，觀察制粒情況。

1.2.2.2稀釋劑選擇 選擇市場常用的稀釋劑進行試驗。淀粉價廉易得，性質穩定，是制備片劑最常用的稀釋劑；乳糖流動性和可壓性較好，性質也穩定，但成本較一般稀釋劑偏高；甘露醇易溶于水，無引濕性，不適用；糊精可與淀粉相配伍，微溶于水，不溶于乙醇，兼有黏合作用；微晶纖維素近年來被廣泛用作片劑的輔料，除作為稀釋劑外，還兼有潤滑、崩解和黏合作用[7]。故選用淀粉、糊精和微晶纖維素作為混合稀釋劑進行制粒，并對顆粒的流動性進行考察，以休止角作為判定依據，使用休止角測定儀測定，考察顆粒的流動性[8]。休止角小于40°，摩擦力較小，可滿足生產中的流動性需求；≥40°時摩擦力大，則流動性較差。

1.2.2.3崩解劑選擇 分別以CMS-Na和干淀粉為崩解劑開展預試驗，以崩解時間和制劑性狀作為依據進行考察。

1.2.2.4潤滑劑選擇 硬脂酸鎂、滑石粉為常用潤滑劑，考慮滑石粉用量較大，選擇硬脂酸鎂開展預試驗，并比較所制片劑外觀。

1.2.3正交設計 選取4個因素(乙醇用量、混合稀釋劑用量、硬脂酸鎂用量、CMS-Na用量)，每個因素取3個水平設計正交試驗表開展平行試驗。并以軟材黏性、顆粒外觀、片劑成型、硬度、脆碎度作為評價指標，確定最終綜合評分(軟材黏性×10%+顆粒外觀×10%+片劑成型×30%+硬度×40%+脆碎度×10%)[9]。

1.2.4質量檢查 依據藥典標準開展片劑常規數據檢查。

1.2.4.1重量差異 參照《中國藥典》2020版四部片劑重量差異項規定的方法進行檢查[10]。分別取不同批次藏紅花總苷片20片，精密稱定總重量和每片重量，計算平均片重及重量差異限度。

1.2.4.2崩解時限 取藏紅花總苷片6片，按崩解時限檢查法(《中國藥典》2020版四部0921項)檢查，分別置于連接吊籃的玻璃管中，加擋板，啟動崩解儀，記錄崩解時間。

1.2.4.3鑒別 取藏紅花總苷片5片研細后精密稱取，加50%甲醇超聲溶解，濾紙常壓過濾，制得供試品溶液備用；另取藏紅花素1及藏紅花酸對照品各2 mg至10 mL容量瓶中，加甲醇溶解稀釋分別制得對照品溶液；同時，制備空白溶劑作為參照，進行薄層色譜法(《中國藥典》2020版四部0502項)試驗[10-11]。

1.2.5含量測定方法學考察 依據藥典標準開展實驗，具體方法如下。

1.2.5.1色譜條件 吸收波長：440 nm；色譜柱：ZORBAX SB-C18柱；流動相：甲醇-0.05%醋酸水55∶45；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃[12]。

1.2.5.2對照品溶液的制備 精密稱取藏紅花素1對照品2.5 mg和藏紅花酸對照品2.0 mg分別置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇水溶液溶解稀釋至刻度，即得濃度為0.25 mg/mL的藏紅花素及0.2 mg/mL的藏紅花酸對照品儲備液。

1.2.5.3供試品溶液的制備 取藏紅花總苷若干片研細，精密稱定0.3 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加50%甲醇水溶液超聲溶解、補足重量、過濾、搖勻，得到3 mg/mL的供試品溶液。

1.2.5.4專屬性試驗 分別取藏紅花素1、藏紅花酸對照品溶液、供試品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，比較高效液相色譜圖。

1.2.5.5線性關系考察 精密吸取藏紅花素對照品儲備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL，藏紅花酸對照品儲備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL，分別置于1 mL容量瓶中，加入50%甲醇水定容至刻度即得。以峰面積為縱坐標、對照品濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.5.6精密度試驗 分別精密量取藏紅花素1對照品溶液和藏紅花酸對照品2 mL各置于6只10 mL的容量瓶中，50%甲醇水溶液溶解稀釋至刻度，搖勻。將溶液分別進樣，記錄峰面積，考察精密度。

1.2.5.7重復性試驗 取供試品按“1.2.5.3”項方法平行制備6份，分別注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計算相對標準偏差(RSD)。

1.2.5.8穩定性試驗 精密吸取供試品溶液10 μL，分別于0、4、8、12、16、24 h注入高效液相色譜儀，測定峰面積，考察穩定性。

1.2.5.9回收率實驗 精密稱取已知含量藏紅花總苷片6份，按高、中、低3個水平精密加入各對照品適量，計算藏紅花素1和藏紅花酸回收率。

1.2.5.10含量測定 分別取市售西紅花總苷片和自制藏紅花總苷片各5片，精密稱定，研細，按“1.2.5.3”項方法制成西紅花總苷片待測液和藏紅花總苷片待測液，分別注入高效液相色譜儀進行檢測，計算平均每片西紅花總苷片中藏紅花素1和藏紅花酸含量。

2 結 果

2.1輔料篩選結果

2.1.1潤濕劑 選用75%乙醇作為潤濕劑制粒情況較好。見表1。

表1 潤濕劑選擇結果

2.1.2稀釋劑 用淀粉∶糊精∶微晶纖維素1∶1∶2比例混合時制得的顆粒流動性較好。見表2。

表2 稀釋劑選擇結果

2.1.3崩解劑 干淀粉用量大，并且可壓性和流動性較差；而CMS-Na用量適宜，具有良好的潤濕性和崩解作用，故選用CMS-Na作為崩解劑，以100粒用量0.2 g為宜。見表3。

表3 崩解劑選擇結果

2.1.4潤滑劑 用硬脂酸鎂作為潤滑劑，100粒用量0.1 g更符合要求。見表4。

表4 潤滑劑選擇結果

2.2正交設計結果 正交設計因素水平見表5。根據藥典要求片劑載藥量對應的日服生藥不得超過20 g，結合前期實驗結果，20 g梔子藥材中約提取藏紅花總苷0.24 g，參考市場西紅花總苷片每次服用4片，每天3次，設計片重為0.04 g，載藥量為50%。稱取藏紅花總苷2.0 g，采用濕法擠出制粒的壓片工藝，按正交設計量加入輔料，反復過篩混合均勻、制軟材、制粒、55°干燥2.5 h、壓片。綜合評分實驗結果見表6。4個因素對片劑處方的影響順序依次為B>D>C>A，確定片劑成型的優選處方為A2B1C2D3。

表5 L9(34)正交設計因素水平

表6 L9(34)正交設計安排及實驗結果

續表6 L9(34)正交設計安排及實驗結果

2.3質量檢查結果 本品為薄膜衣片，外表光滑，除去薄膜衣后顯橙黃色至棕紅色，氣微香，味辛辣。

2.3.1重量差異結果 符合藥典規定標準，結果見表7。

表7 片劑重量差異檢查

2.3.2崩解時限結果 符合藥典規定標準，結果見表8。

表8 崩解時限測定

2.3.3鑒別結果 供試品色譜中在與對照品溶液色譜相應的位置上顯相同的黃色斑點；再噴以濃硫酸-香草醛溶液，斑點顯色清晰。

2.4方法學考察結果 在藏紅花素1及藏紅花酸保留時間附近無其他成分峰干擾，證明該方法的專屬性較強。色譜圖見圖1。

A：藏紅花素1對照品；B：藏紅花酸對照品；C：供試品。1.藏紅花素1；2.藏紅花酸。

2.4.1線性關系考察 藏紅花素1線性回歸方程：Y=122.24X-0.012 3，r=0.999 9；線性范圍：0.25～2.50 μg；藏紅花酸線性回歸方程：Y=115.53X-0.306 6，r=0.999 7；線性范圍：0.2～2.0 μg。見圖2。

圖2 線性關系考察

2.4.2精密度RSD分別為1.01%和0.98%，表明儀器精密度和方法精密性均良好。

2.4.3重復性RSD分別為1.51%和1.18%，表明方法的重復性良好。

2.4.4穩定性RSD分別為1.45%和1.26%，表明樣品在24 h內穩定性良好。

2.4.5回收率 藏紅花素1和藏紅花酸的回收率測定結果見表9。

表9 回收率測定結果(n=6)

2.4.6含量測定結果 每片西紅花總苷片中含藏紅花素1和藏紅花酸的量分別為12.011、1.321 mg，每片自制的藏紅花總苷片中含藏紅花素1和藏紅花酸的量分別為12.512、1.208 mg。

3 討 論

藏紅花總苷是藥材藏紅花和梔子中共有的一類化合物，目前，市場上該類成分相關制劑多以藏紅花為原料藥材，價格高昂。本研究首次選用我國資源豐富的梔子作為原料藥材可節約成本，制成藏紅花總苷片可作為市場西紅花總苷片的補充和參考。提取純化工藝中通過重結晶的方法，解決了單純大孔樹脂分離純度不高的缺陷。采用單因素考察、正交設計等方法對提取方案中的溶劑、溫度及提取次數，吸附試驗中吸附樹脂的選擇、溫度對吸附劑性能的影響、洗脫流速等進行了充分的考察和研究，從而篩選出最佳提取純化工藝，提高了實驗效率；制備工藝研究中充分考慮藥粉吸濕性、片劑成型、崩解、脆碎度及制粒和壓片時的環境濕度，通過單因素考察和正交設計比較不同輔料種類和用量最終確定制備工藝條件；并結合藥典對片劑的基本要求確保藥品質量。在方法學考察實驗過程中建立了藏紅花素1和藏紅花酸2種成分同時測定的方法，并嘗試了多種流動性系統，如甲醇-水、乙腈-水，發現55∶45甲醇-0.05%醋酸水可獲得較好峰形且樣品的分離度較好。對所制制劑開展質量標準的相關研究進行了系統的方法學驗證，為后續研究奠定了基礎。同時，2010、2015、2020版《中國藥典》均以梔子苷作為指標成分對梔子及制劑進行定量分析，對梔子中另一重要成分——藏紅花苷類化合物尚未建立相關質量標準，在對梔子藥材進行客觀評價及梔子制劑質量控制時缺乏說服力，本研究結果為將藏紅花素1或藏紅花酸作為對照品一同納入藥典標準對梔子及其制劑進行質量控制提供了數據參考。

綜上所述，梔子是我國一種常見的果實類藥材，其成分的開發、利用已有悠久歷史，隨著現代醫學藥學和分子生物學等領域的飛速發展，梔子中藏紅花總苷的藥理作用已得到充分肯定，特別是其抗癌活性和抗癌機制的研究使該類物質很有可能成為未來理想的抗癌藥物之一；其強力的降血脂和活血化瘀功效也使藏紅花苷類單體化合物有望成為治療心腦血管疾病的主流藥物[13]。本研究以梔子作為原料藥材，提取分離出藏紅花總苷類成分并純化，選擇適當輔料確定片劑的最終制備工藝，并初步開展了該制劑科學、合理的質量研究，為藏紅花總苷片的發展及藥典中其質量標準的正式建立提供了一些新的思路和參考。