手性毛細管電泳實驗中手性選擇劑取代度的影響研究

謝天堯，鄧愛玲，肖華，朱芳

中山大學化學學院，廣州 510275

當藥物分子結構含有手性中心時，由于空間構型的不同就可以得到結構上互為鏡像的一對分子，成為對映異構體。手性藥物對映體在人體內往往顯示出不同的生理和藥物治療效果，通常只有一種有藥理活性，另外一種活性很弱，或沒有活性，甚至有毒副作用[1,2]。由于對映體的化學組成、理化性質均完全相同，用一般的方法難以得到分離，因此手性藥物對映體分離檢測方法是分析化學研究的熱點和難點之一[3,4]。手性毛細管電泳具備分離效率高、試劑消耗少、環境友好、分析成本低等特點，在手性化合物的分離分析中極具應用前景[5,6]。由于手性毛細管電泳的運行和維護成本較低，從根本上解決了在實驗教學中開展手性藥物對映體分離檢測存在的實驗費用昂貴問題。為此，我們“儀器分析實驗”教學小組在科研成果基礎上[7]，設計開發出“毛細管電泳/非接觸式電導分離檢測手性藥物氧氟沙星對映體”的實驗教學內容，并應用于我院本科生的實驗教學[8,9]。該實驗理論與實踐相結合，采用了熟知的市售手性藥物氧氟沙星，且學生能夠親自動手操作毛細管電泳儀器進行手性藥物對映體的分離檢測，深受學生歡迎。

氧氟沙星(Ofloxacin)是常見的喹諾酮抗菌類藥物，在臨床上有著廣泛的應用。氧氟沙星屬于手性藥物，存在2個對映體分子(S-ofloxacin，R-ofloxacin)。羥丙基-β-環糊精結構式中含有多個手性中心并略呈錐形的中空圓筒立體杯狀結構[10]。其外緣親水而內腔疏水，由于其獨特的結構特性使其作為主體可以選擇性地與合適的客體分子形成包合物。這種選擇性的包絡作用即通常所說的分子識別。羥丙基-β-環糊精的空腔結構與氧氟沙星分子結構匹配，能夠形成穩定的包合物，如圖1所示。由于羥丙基-β-環糊精與氧氟沙星的2個對映體分子之間所形成的包合物具有不同的穩定常數，在手性毛細管電泳中其電泳淌度將會表現出顯著差異，進而可采用毛細管電泳-非接觸式電導法(CE-C4D)實現氧氟沙星對映體的良好分離和靈敏檢測。

圖1 羥丙基-β-環糊精與氧氟沙星的包合反應

在教學實踐過程中，我們發現所采用的手性選擇劑羥丙基‐β‐環糊精除了濃度對氧氟沙星對映體的分離效果存在顯著影響外，還存在著取代度的影響。這是以前被忽略而沒有引起重視的一個較為重要的因素。具體表現為不同品牌、不同產家，甚至是同一產家在不同時期所提供的羥丙基‐β‐環糊精，雖然商品名稱相同但對氧氟沙星對映體的分離效果存在顯著差異，造成實驗結果的異常波動，影響了實驗教學效果。經查閱文獻資料，并反復試驗，最終確定引起對映體分離效果異常波動的主要原因是手性選擇劑羥丙基‐β‐環糊精的取代度不同所造成。

為此，本文系統研究了不同取代度的羥丙基‐β‐環糊精對手性藥物氧氟沙星對映體的分離度影響，尋找出最佳取代度的羥丙基‐β‐環糊精。同時依據取代度的測定方法，提出對市售羥丙基‐β‐環糊精質量的評估方法，以確保手性毛細管電泳實驗結果的穩定性和取得良好教學效果。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

毛細管電泳儀(配備非接觸式電導C4D檢測器，廣州涵天科儀公司)；石英毛細管柱(50 μm id.，邯鄲永年銳沛色譜器件公司)；臺式高速離心機(湖南湘儀公司)。

乙酸、乙酸鈉、NaOH、HCl (廣州化學試劑廠)；氧氟沙星對照品(中國計量科學研究院)。不同取代度(DS = 4.1，6.2，7.9，9.1)的羥丙基-β-環糊精(HP-β-CD)購自化學試劑公司。所用試劑除注明外均為分析純。水為超純水。

市售左旋氧氟沙星和氧氟沙星片劑(或者是滴眼液)購自廣州市當地的藥店超市。

電泳運行液用時現配。質量濃度為100 mg?L?1的氧氟沙星對照品標準儲備液，保存在4 °C的冰箱中。實驗時，取適量的上述標準品儲備液用超純水配成不同濃度的標準工作溶液。

1.2 樣品處理

市售氧氟沙星藥片(包括左旋體和外消旋體氧氟沙星藥片，標示含量100 mg/片)，經超聲助溶和0.45 μm濾膜過濾后制成樣品溶液。對于滴眼液樣品(標示含量2.40 mg/支，0.8 mL)，可直接用超純水稀釋。進樣時，用50 μmol?L?1HAc + 5 mmol?L?1HP-β-CD溶液稀釋到合適濃度，上機測定。

1.3 實驗步驟和相關參數

石英毛細管在使用前的處理及其他實驗條件參照文獻方法[8]。實驗中，每2次進樣之間僅需用運行液沖洗3 min，基線運行6 min。CE儀器參數：分離電壓：+15 kV，電動進樣：+11 kV × 8 s；石英毛細管：45 cm × 50 μm i.d.，Leff= 40 cm；C4D檢測器的信號經數據工作站采集到計算機中，進行電泳譜圖顯示、數據存儲和定量分析處理。

2 結果與討論

2.1 樣品分析及結果

在選定的實驗條件下，按1.2節方法處理實際樣品和進樣分析。通過標準加入法確定CE-C4D譜圖中氧氟沙星對映體(S-ofloxacin，R-ofloxacin)所對應的電泳峰。結果表明，S-ofloxacin峰在前，R-ofloxacin峰在后，參見氧氟沙星對映體的CE-C4D譜圖。以取代度7.9的羥丙基-β-環糊精為手性選擇劑，對某廠家氧氟沙星藥片和氧氟沙星滴眼液的測定結果分別為101 mg/片和2.45 mg/支，與產品標示值100 mg/片和2.40 mg/支相符。

2.2 羥丙基‐β‐環糊精取代度對分離度的影響

羥丙基-β-環糊精是由β-環糊精經衍生化獲得，文獻方法一般采用β-環糊精和環氧丙烷在氫氧化鈉的作用下通過取代反應合成[10–12]，見圖2。

圖2 羥丙基-β-環糊精的合成

β-環糊精由7個葡萄糖單元組成，而每個葡萄糖單元中2位和6位上的羥基易反應，因此β-環糊精骨架上有14個易發生取代反應的活性位點[10,12]。這些活性位點在與環氧丙烷的反應中由于受到反應溫度、時間和原料比的影響，將會產生多種取代度的產物，其中原料配比是決定羥丙基-β-環糊精取代度的重要因素[12]。在實際工作中，用平均取代度DS (degree of substitution)來代表環糊精骨架上羥基被取代的數量。文獻[13]指出不同取代度的羥丙基-β-環糊精與客體藥物分子之間的包合物表觀平衡常數存在顯著的差異。

為此，本實驗中采用4種不同取代度(DS = 4.1，6.2，7.9，9.1)的羥丙基-β-環糊精，考察其對氧氟沙星對映體分離度的影響。不同取代度羥丙基-β-環糊精的氧氟沙星對映體分離度測定結果見表1，其CE-C4D譜圖如圖3所示。

由表1和圖3可知，不同取代度的羥丙基-β-環糊精對氧氟沙星對映體的分離度存在顯著差異，當DS = 7.9時分離度最大。文獻[10,13]指出環糊精與客體分子之間的包合過程是氫鍵、范德華力和疏水作用力三者協同作用的結果。不同取代度的羥丙基-β-環糊精由于羥丙基數目的不同，造成了與客體分子氧氟沙星2個對映體分子之間包合物平衡常數的差異，而這種差異在DS = 7.9時達到最大。反映在CE分離上，取代度7.9的羥丙基-β-環糊精作為手性選擇劑時，可獲得最佳的對映體分離度。應當指出，對于不同分子結構的手性藥物，由于其與羥丙基-β-環糊精的包合作用力也不同,因此適合不同手性藥物對映體分離的DS值也將不同。

圖3 不同取代度羥丙基-β-環糊精分離氧氟沙星對映體的CE-C4D譜圖

表1 不同取代度羥丙基-β-環糊精的氧氟沙星對映體分離度測定結果(n = 5)

2.3 市售羥丙基-β-環糊精的質量評估

由2.2節可知，不同取代度羥丙基‐β‐環糊精對氧氟沙星對映體的分離效果有較大影響，且當DS = 7.9時分離度最佳。因此，十分有必要對市售羥丙基‐β‐環糊精的取代度進行測定，對其質量進行評估，以確保手性毛細管電泳實驗結果的穩定性和良好的教學效果。羥丙基‐β‐環糊精取代度的方法有很多種，如核磁共振氫譜法[12]、質譜法[14]、色譜法和容量法[15–17]等。核磁共振氫譜法是根據核磁共振譜圖的積分曲線計算取代度，與其他方法比較，核磁共振氫譜法具有簡單快速的特點。本文采用核磁共振氫譜法對上述不同取代度(DS = 4.1，6.2，7.9，9.1)的市售羥丙基‐β‐環糊精進行取代度測定，測定結果與產品標示值基本一致，相對誤差在3%以內。因此核磁共振氫譜法是評估市售羥丙基‐β‐環糊精質量的良好方法。對于一般實驗室，可采用化學滴定法測定羥丙基‐β‐環糊精的取代度[17]。

3 結語

本研究選取4種不同取代度的羥丙基‐β‐環糊精，采用毛細管電泳-非接觸式電導法研究了其對氧氟沙星對映體的分離度影響。結果表明，取代度DS = 7.9的羥丙基‐β‐環糊精具有最優的分離度。據此對市售羥丙基‐β‐環糊精的質量進行評估，可確保手性毛細管電泳實驗的結果穩定性和良好教學效果。同時，為深入探討不同取代度的羥丙基‐β‐環糊精對其他手性藥物對映體的分離提供了參考。