點擊化學和生物正交化學中的化學基礎概念和前沿思想
——2022年諾貝爾化學獎淺析

李恒宇，賴鋮陽，黃思齊，陳興,＊

1北京大學化學與分子工程學院，北京 100871

2北京大學附屬中學道爾頓學院，北京 100190

2022年10月5日，瑞典皇家科學院宣布將2022年諾貝爾化學獎頒發給美國化學家Carolyn R.Bertozzi、丹麥化學家Morten Meldal和美國化學家K. Barry Sharpless，以表彰他們開創并發展了點擊化學和生物正交化學(圖1a)[1]。

圖1 (a) Bertozzi (中)、Meldal (左)和Sharpless (右)三位科學家因開創點擊化學和生物正交化學獲得2022年諾貝爾化學獎；(b) 以一價銅催化的疊氮-炔環加成為代表的點擊化學;(c) 基于生物正交化學的非天然糖代謝標記

點擊化學(click chemistry)的概念由Sharpless于2001年創造并提出，指的是一類模塊化、高選擇性、條件溫和、高產率的偶聯反應，以實現功能分子的高效快速合成[2]。在傳統的有機合成化學中，為了追求產率和效率，分子骨架的構建通常需要在有機溶劑中進行，并使用升溫、酸或堿、惰性氣體保護等條件。很多有機反應還需要對活潑基團進行預先的保護，導致合成過程變得復雜和繁瑣。羥醛縮合就是這類反應的一個典型例子，常在復雜分子合成中用以構建碳―碳(C―C)鍵。相反地，大自然則熟練地在常溫、中性pH的水溶液中引發各種生化反應，將各種單體分子模塊，通過脫水縮合形成碳―雜原子(C―X)鍵，合成各種生物大分子。師法自然，點擊化學的核心思想是強調反應的高效性和功能性。2002年，Sharpless和Meldal分別獨立報道了一價銅催化的疊氮-炔環加成(copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)反應(圖1b)[3,4]。這個反應在高分子、藥物分子、材料等的合成中迅速得到廣泛應用，成為點擊化學“皇冠上的明珠”[5,6]。

生物正交化學(bioorthogonal chemistry)的概念由Bertozzi于2003年正式提出，指一類應用于生命體系的快速、選擇性標記反應，這類反應與生物體內的生物化學過程互不干擾，相互“正交”[7,8]。實際上，生物正交反應的開發可以追溯至20世紀90年代末Bertozzi課題組為解決糖質(glycan)標記難題所做的工作[9]。細胞作為生命體的基本組成單元，其微小體積下的內部結構卻是復雜和擁擠的，需要依賴各種生物分子的協調配合才能行使正常的生物學功能。為了在細胞中研究糖質這一重要生物大分子的功能，Bertozzi課題組發展了非天然糖代謝標記(metabolic glycan labeling)技術，將含有生物正交反應基團的單糖代謝整合到糖質中，繼而利用生物正交反應連接熒光探針，實現糖質特異性標記和觀測(圖1c)[10]。1997年，他們運用醛酮和酰肼的偶聯反應，對細胞表面的唾液酸化糖質進行化學標記[11]。然而，醛酮-酰肼偶聯反應需要酸性條件，不利于活細胞標記。為了解決這一問題，Bertozzi課題組1998年開發了疊氮和三苯基膦之間的Staudinger連接反應，這是第一個生物正交反應[12]。盡管Staudinger連接反應在糖質標記等生物標記中得到了廣泛的應用，但它仍存在反應速率不夠快等不足。另一方面，CuAAC反應具有極佳的反應動力學，然而一價銅催化劑具有細胞毒性，限制了其在生物標記中的應用。為了克服銅毒性的問題，2004年Bertozzi課題組報道了疊氮-環辛炔之間的環張力促發疊氮-炔環加成(strain-promoted azide-alkyne cycloaddition，SPAAC)反應，也被稱為無銅催化的點擊化學反應(copper-free click chemistry)[13]。隨著生物正交化學的發展，非天然糖代謝標記也成為了在活細胞和活體中糖質標記和功能解析的主要方法之一[14]。

從此，生物正交化學和點擊化學逐漸被統一起來，二者分別從生物正交標記和有機合成方法學出發，殊途同歸，成為了在化學合成、生物標記、材料制備等領域最重要的化學反應工具之一。作為在合成化學和化學生物學領域的開創性方法，點擊化學成功地借鑒了自然界合成生物分子的化學機制，而生物正交化學成功地建立了探究生命科學的化學方法，可以說它們分別是“源自生命的化學”和“探索生命的化學”。實際上，點擊化學和生物正交化學的開發和建立，運用了許多有機化學和物理化學的基礎概念和理論。本文就這些基礎概念進行一些探討，以期對讀者思考和探索化學前沿有些許啟發。

1 從Staudinger反應到Staudinger連接反應

1.1 葉立德和Staudinger反應

葉立德(ylide)又稱鄰位兩性離子，通常指第三周期元素與碳或氮結合，碳原子或氮原子帶負電荷、雜原子帶正電荷且均保持完整電子隅的一類化學結構，以磷葉立德和硫葉立德最為常見。磷葉立德的磷原子可以利用其3d軌道和碳原子或氮原子的p軌道形成具有強極性的p–d π鍵，具有很強的親核性(圖2a)。在Wittig反應中，磷葉立德與酮或醛的羰基發生親核加成，形成烯烴(圖2b)。磷葉立德也常被稱為Wittig試劑。1919年，德國化學家Hermann Staudinger報道了疊氮化物與膦之間的Staudinger反應[15]。以三苯基膦和疊氮化物的反應為例，磷原子親核進攻疊氮基團末端的氮原子后生成氮雜四元環中間體，隨后氮氣離去生成氮雜磷葉立德，最終水解生成胺和三苯基氧膦(圖2c)。由于所形成的中間體會釋放氮氣，Staudinger反應具有較強的驅動力和較快的反應速率。

圖2 (a) 磷葉立德結構式；(b) Wittig反應；(c) Staudinger反應；(d) Staudinger連接反應

1.2 Staudinger連接反應的驅動力改良

疊氮基團在細胞中不存在，且在生理條件下具有優異的化學穩定性，具備作為生物正交反應基團用于非天然糖代謝標記的基本條件。要實現糖質的生物正交標記，則還需要開發對疊氮進行連接的生物正交反應。盡管Staudinger反應具有良好的反應動力學，但是最后一步水解使得兩種反應物無法生成偶聯產物。基于這些考慮，Bertozzi課題組于2000年對Staudinger反應的驅動因素進行了改良，報道了終產物為偶聯形式的Staudinger連接反應[12]。開發該反應的關鍵是在三苯基膦的一個苯環的鄰位接上甲酸甲酯，因而所形成的氮雜磷葉立德不發生水解，而是生成五元環內酰胺，最后水解形成偶聯產物(圖2d)。

相比于傳統的Staudinger反應，Staudinger連接反應的驅動力在以下兩方面發生了改變。首先，苯甲酸甲酯的羰基碳原子受到氮上孤對電子的進攻，形成酰胺。對于羧酸衍生物，在酸催化或堿催化下發生親核取代的反應活性從高到低依次為：酰鹵>酸酐>酯>酰胺[16]。相比于苯甲酸甲酯，生成的酰胺具有更高的穩定性，因此在氮上孤對電子的進攻后甲氧基易于離去而生成酰胺，然后再發生水解。再者，氮原子進攻為分子內反應，且生成五元環。根據張力學說，五元環、六元環具有最好的穩定性[16]。因此，這兩種驅動力使得反應朝著形成內酰胺的方向進行。

通過增加以上兩種反應驅動力因素，Bertozzi課題組成功地將Staudinger反應從一個非連接反應改造為連接反應，成功開發出了疊氮與三苯基膦之間的生物正交反應。在生物正交化學的發展歷程中，Staudinger連接反應被普遍認為是第一個真正意義上的生物正交反應，也被稱為Staudinger-Bertozzi連接反應。

2 一價銅催化的疊氮-炔環加成反應

2.1 1,3-偶極體和疊氮-炔的1,3-偶極環加成

1,3-偶極體(1,3-dipole compound)是一類具有三原子四電子π體系，可以用偶極共振式來描述的化合物，例如臭氧、重氮甲烷和疊氮化合物等。這類化合物具有與烯丙基負離子類似的分子軌道，能與烯烴、炔烴等親偶極體發生環加成反應，生成五元環狀化合物。根據前線軌道理論，化學反應的發生要求一個反應物分子的HOMO軌道和另一反應物分子的LUMO軌道對稱性匹配且能級接近[17]。對于1,3-偶極環加成反應，在符合這些要求的情況下，可以根據1,3-偶極體的不同分為若干反應類型。

1960年代初，德國化學家Rolf Huisgen報道了一種疊氮化物與炔基化合物之間的1,3-偶極環加成反應[18]。在加熱條件下，兩種反應物發生總電子數6π體系的協同反應，經過五元環過渡態生成1,2,3-三氮唑并放出熱量(圖3a)。這個[2+3]環加成反應大量放熱，且疊氮基和炔基均可在水相、開放的環境中穩定存在，符合Sharpless所提出點擊化學基本要求的其中幾點。然而，該反應歷程中形成五元環狀過渡態的活化能較高，因而需要加熱以提高反應速率。此外，對于碳碳三鍵兩端取代基不同的炔基化合物，該反應的區域選擇性較差，得到的是1,4-取代和1,5-取代的兩種產物的混合物。因此，如要將疊氮-炔間的1,3-偶極環加成開發成點擊化學，需要從降低活化能和提高區域選擇性兩方面進行優化。

2.2 一價銅催化的疊氮-炔環加成反應

2002年，Sharpless和Meldal分別獨立發現一價銅催化劑可以完美地解決上述問題[3,4]。碳碳三鍵能夠和一價銅離子形成配位鍵，而且末端炔基容易電離氫離子并和另一個一價銅離子配位形成炔基銅化合物。隨后，疊氮取代另一個配體與一價銅鍵合，炔基β碳原子親核進攻疊氮末端氮原子，形成一個獨特的六元環中間體，銅由一價變為三價。這一反應中間體不穩定，容易發生縮環產生穩定性更好的五元芳香雜環化合物，并使銅從三價回到一價，最終完成催化循環(圖3b)[19]。由于一價銅在水溶液中不穩定，通常由抗壞血酸鈉等還原劑原位還原二價銅產生。除了一價銅以外，其他二價釕也被發現可以催化這一反應[20]。

圖3 (a) Huisgen疊氮-炔環加成反應；(b) CuAAC反應；(c) SPAAC反應

根據催化反應動力學理論，催化劑通過改變反應途徑從而降低反應活化能，提高反應速率[21]。在一價銅的催化下，疊氮-炔環加成反應的反應途徑發生了改變，活化能大幅降低，使得該反應可以在常溫下高效快速進行(圖4a)。除了優異的反應動力學外，CuAAC反應還具有一系列優點。例如，該反應既可以在有機溶劑中進行，也可以在水相和醇溶劑中發生。CuAAC反應對底物兼容性很好，并且基本不受其他活性官能團的干擾。該反應所產生的三氮唑產物通常易于純化。這些特點使得CuAAC成為了一個簡單易用且溫和高效的反應，迅速得到大量的應用，也成為了點擊化學的代名詞。

圖4 (a) CuAAC反應通過一價銅離子催化劑改變反應過渡態，從而降低反應活化能；(b) SPAAC反應通過環張力活化反應物，從而降低反應活化能

3 環張力驅動的疊氮-炔環加成反應

Bertozzi課題組于2004年報道的SPAAC反應則利用環張力來取代一價銅催化劑，從而解決CuAAC在生物應用中的毒性問題(圖3c)[13]。除了通過合適的催化劑來降低反應的活化能(圖4a)，提高反應物自身的能量也可以使活化能降低(圖4b)。根據這一思路，Bertozzi等人設計了八元環炔類化合物。由于炔基的碳碳三鍵中的碳原子是sp雜化，鍵角為180°，八元環的張力使得環辛炔活性增加，可以在室溫下與疊氮基高效快速地發生反應。更小的環炔(如環庚炔和環己炔等)則由于環張力過大，在室溫下不穩定。當然，SPAAC也不可避免地會得到1,4-取代和1,5-取代的兩種產物。不過，對于生物標記的應用來說，這一影響不大。SPAAC也被稱為無銅催化的點擊化學，在實際應用中也漸漸模糊了點擊化學和生物正交化學的界線，逐漸將兩種化學反應統一起來。

4 結語

點擊化學和生物正交化學是化學概念和理念上的創新和突破。縱觀現代科學的發展歷程，科學新發現和新概念是最重要的兩類驅動力，而且這兩者之間是相輔相成、相互促發的。Sharpless教授在2001年前瞻性地提出了點擊化學的概念，開創了點擊化學這個領域。這應是得益于這位最富創造性的化學家長期以來對有機化學合成在理念層面深入的思索。Sharpless課題組還于2014年開發出了“第二代”點擊化學——六價硫氟交換(sufer(VI)-fluoride exchange，SuFEx)反應，繼續引領點擊化學的發展前沿[22]。Bertozzi教授則在2003年歸納了其課題組在之前5年利用化學標記進行糖質成像的工作，抽象并提出了生物正交化學這一全新的概念，從而促進這個領域的迅猛發展。當前，生物正交反應仍然是化學生物學中最活躍的一個方向，發展出了包括反式環辛烯和四嗪分子之間的Diels-Alder反應等一系列新型的生物正交化學[23]。在實際學習和科學研究中，我們往往會在一定程度上忽視提出和歸納新概念的重要性。點擊化學和生物正交化學概念的提出，值得我們認真體會和借鑒。

重大的科學突破常常離不開基本知識和原理。點擊化學和生物正交化學的開發和發展過程，正是化學基礎概念在解決前沿科學問題中發揮關鍵作用的體現。三位科學家巧妙地運用化學的基礎概念和原理，對傳統的化學反應進行改造，使之成為目前在化學、生命科學、材料科學等領域具有廣泛應用價值的化學反應。這也再次提醒我們，扎實掌握基礎知識是取得科學前沿突破的必要條件。