肺炎克雷伯菌的喹諾酮類(lèi)耐藥株gyrA 基因研究

郭麗娜 王家欣 姚文 劉琦琦

目前,用于治療由肺炎克雷伯菌所致感染的抗菌藥物包括碳青霉烯類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)等。其中,喹諾酮類(lèi)抗菌藥物具有抗菌譜廣、抗菌作用強(qiáng)、生物利用度高、組織滲透性好、不良反應(yīng)較少等優(yōu)點(diǎn),受到臨床重視。然而隨著喹諾酮類(lèi)藥物的廣泛應(yīng)用,耐喹諾酮類(lèi)肺炎克雷伯菌的出現(xiàn)已非常普遍［1,2］,有資料顯示肺炎克雷伯菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物耐藥主要是由DNA 回旋酶的A 亞基的gyrA 基因突變引起變異［3］,且存在地域差異［4］。為了解本地區(qū)肺炎克雷伯菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制,共收集43 株耐喹諾酮類(lèi)藥物的臨床菌株,采用PCR 檢測(cè)gyrA 基因,擴(kuò)增產(chǎn)物純化后測(cè)序,進(jìn)而探討其相關(guān)耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 收集本院2017 年1 月～2018 年12 月期間臨床樣本分離的肺炎克雷伯菌的喹諾酮類(lèi)耐藥株43 株,其中痰液21 份,尿液6 份,靜脈血5 份,穿刺液5 份,膽汁4 份,腹水2 份。標(biāo)本留取規(guī)范,送檢及時(shí),剔除不符合送檢標(biāo)準(zhǔn)者(痰標(biāo)本涂片鏡檢應(yīng)符合：白細(xì)胞>25/LP,上皮細(xì)胞<10/LP),結(jié)合涂片和培養(yǎng)結(jié)果,剔除污染菌。菌株均經(jīng)Phoenix 100 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定,鑒定相似度>99%。

1.2儀器與試劑 Phoenix 100 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)(美國(guó)BD 公司)；引物及測(cè)序由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司完成；PCR 擴(kuò)增試劑及瓊脂糖購(gòu)自北京瀚海康泰醫(yī)藥科技有限公司；Eppendorf PCR 儀；凝膠成像儀［上海勤翔(Clinx)］；OMEGA 切膠純化試劑盒。

1.3藥敏試驗(yàn) 采用Phoenix 100 革蘭氏陰性細(xì)菌藥敏板進(jìn)行藥敏試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果判斷參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinicai and Laboratory StandardsInstitute,CLSI)標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC 25922,銅綠假單胞菌ATCC 27853,標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.4基因檢測(cè)模板制備 采用堿裂解液法,將1.5 ml 37℃過(guò)夜純培養(yǎng)的細(xì)菌于4℃ 10000 r/min 離心2 min,收集菌體,重懸于500 μl dd H2O 溶液中,95℃水浴20 min 后,4℃10000 r/min 離心5 min,保留上清液,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5PCR 檢測(cè)gyrA 基因 PCR 擴(kuò)增體系：模板1.5 μl,上游和下游引物各1 μl,Primer STAR Max 25 μl,dd H2O 21.5 μl,共50 μl。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min,接著95℃30 s →58℃30 s →72℃45 s,共35 個(gè)循環(huán),最后72℃延長(zhǎng)5 min。按照OMEGA 切膠純化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR 產(chǎn)物純化。純化后的產(chǎn)物送至通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與肺炎克雷伯菌的標(biāo)準(zhǔn)gyrA 基因序列進(jìn)行比對(duì)。本文PCR 檢測(cè)所用的引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR 檢測(cè)所用引物序列

2 結(jié)果

2.1肺炎克雷伯菌gyrA 基因PCR 檢測(cè)結(jié)果 43 株肺炎克雷伯菌gyrA 基因的PCR 擴(kuò)增均得到目的片段,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為441 bp,與文獻(xiàn)［5］報(bào)道一致。部分菌株P(guān)CR 產(chǎn)物的電泳圖及gyrA 基因擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 部分菌株P(guān)CR 產(chǎn)物的電泳圖及gyrA 基因擴(kuò)增結(jié)果圖

2.2肺炎克雷伯菌gyrA 基因測(cè)序結(jié)果 所檢測(cè)的喹諾酮類(lèi)耐藥株的gyrA 基因序列與肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)gyrA 基因序列進(jìn)行比對(duì),其基因突變情況見(jiàn)表2。

表2 gyrA 基因突變比對(duì)結(jié)果

3 討論

肺炎克雷伯菌是腸桿菌科重要的細(xì)菌之一,常引起醫(yī)院和社區(qū)感染,且檢出率呈逐年上升的趨勢(shì)［6］,可引起肺炎、泌尿系感染、菌血癥、手術(shù)切口及其他部位感染［7］。近年來(lái)有研究表明：喹諾酮類(lèi)藥物在臨床上被廣泛使用,肺炎克雷伯菌對(duì)這類(lèi)藥物耐藥率呈逐年升高趨勢(shì)［8-10］。

喹諾酮類(lèi)藥物作用的靶位是細(xì)菌的DNA 回旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ,DNA 回旋酶在DNA 復(fù)制,轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起重要作用,可使松弛的DNA 鏈形成超螺旋結(jié)構(gòu),此酶是由2 個(gè)gyrA 基因編碼的gyrA 亞基和2 個(gè)gyrB 編碼的gyrB 亞基組成的四聚體,其中任何一個(gè)亞基的突變都有可能造成喹諾酮類(lèi)藥物耐藥。喹諾酮決定區(qū)域位于第67～106 位氨基酸［5］,其中第83 位絲氨酸的極性對(duì)確定細(xì)菌對(duì)喹諾酮藥物敏感性非常重要［11］。本文43 株肺炎克雷伯菌耐喹諾酮菌株均出現(xiàn)了gyrA 亞基第83 位氨基酸的改變,Ser83→Ala 或Ser83→Thr,這一結(jié)果與國(guó)內(nèi)其他研究者如徐陶等［12］存在不同,可能由菌株流行的地域差異導(dǎo)致,由極性氨基酸絲氨酸變成了非極性氨基酸丙氨酸,使第83 位位點(diǎn)親水性降低,DNA 回旋酶與喹諾酮類(lèi)藥物親和力下降,從而表現(xiàn)為對(duì)該類(lèi)藥物耐藥［3］。本文中有20 株肺炎克雷伯菌發(fā)生了極性氨基酸絲氨酸→蘇氨酸的突變,提示gyrA 基因突變與超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的獲得相關(guān),是肺炎克雷伯菌產(chǎn)生多重耐藥的主要機(jī)制之一［13］。

除了本文中研究的gyrA 基因突變與肺炎克雷菌耐喹諾酮株耐藥機(jī)制相關(guān),質(zhì)粒介導(dǎo)的水平傳播亦可造成菌株對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物耐藥,由質(zhì)粒介導(dǎo)的ESBLs 基因、AmpC 酶基因和喹諾酮類(lèi)藥物耐藥基因可能存在同一質(zhì)粒或同一轉(zhuǎn)移元件中,攜帶多種耐藥基因的質(zhì)粒或轉(zhuǎn)移元件水平傳播,可能造成對(duì)一種藥物耐藥的同時(shí),伴隨著其他藥物也呈現(xiàn)高耐藥表達(dá),這些問(wèn)題課題組將在下一階段研究中證實(shí)。

綜上所述,肺炎克雷伯菌的喹諾酮類(lèi)耐藥株gyrA基因突變非常普遍,監(jiān)測(cè)其突變頻率及特點(diǎn)對(duì)研究喹諾酮類(lèi)耐藥機(jī)制和指導(dǎo)臨床合理用藥非常必要。