‘龍眼’葡萄酒微生物變化及與揮發性香氣的相關性分析

羅飛，師旭，王頡，龐永宏，趙彥敏

（1. 中糧華夏長城葡萄酒有限公司，河北秦皇島 066000；2. 中糧長城桑干酒莊（懷來）有限公司，河北張家口 075400；3. 河北農業大學食品科技學院，河北保定 071000；4. 張家口市食品藥品檢驗中心，河北張家口 075000；5. 河北省張家口市農業廣播電視學校，河北張家口 075000）

‘龍眼’葡萄是中國最具特色和代表性的鮮食釀酒兼用品種，有近千年的栽培歷史，目前主要在懷來地區有集中種植，且面積逐年縮減。據懷來縣統計局數據，2021年‘龍眼’葡萄種植面積約有20 hm2，有兩家企業釀造‘龍眼’干白葡萄酒，其他均以鮮食消費。因此‘龍眼’葡萄面臨被淘汰的風險。

眾所周知，葡萄酒復雜的風味很大部分是一系列微生物代謝活動的結果[1]，微生物對葡萄酒香氣的貢獻，及其在葡萄酒品質中的改良始終在研究之中[2-3]，大量芳香化合物在釀酒酵母初級發酵過程中形成[4]。此外，現有研究表明，接種本土非釀酒酵母可以改善葡萄酒的芳香特征[5]，如有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）和高滲漢森酵母（Hanseniaspora osmophila）可以分泌多種水解酶，有助于葡萄酒花香物質的產生[6]；而葡萄酒微生態系統除以釀酒酵母、非釀酒酵母為代表的真菌群落外，細菌群落也對葡萄酒風味存在重要影響，其中乳酸菌（LAB）具有廣泛的酯合成和水解活性。許多研究中觀察到蘋乳酸發酵（MLF）后，乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乳酸乙酯水平增加[7-8]，其中最常用的酒酒球菌（Oenococcus oeni）的多糖被證明具有與釋放的香氣化合物結合的能力，從而影響最終的葡萄酒香氣[9]。近年來國內外通過高通量測序（HTS）技術報道了不同產區、不同葡萄品種發酵過程中微生物多樣性組成和其此消彼長的變化及其與揮發香香氣的相關性[10]，如‘威代爾’冰白葡萄酒[11]、‘法蘭娜’（Falanghina）甜葡萄酒[12]和‘馬瑟蘭’[13]紅葡萄酒已有報道，然而我國獨有的‘龍眼’干白葡萄酒工業發酵過程尚缺乏相關研究。

本研究對‘龍眼’干白葡萄酒發酵過程中微生物群落變化及其與揮發性香氣變化相關性分析，將為我國本土品種‘龍眼’干白發酵過程中微生物多樣性研究提供一定理論支持，從而了解葡萄酒風味特征的形成和質量控制，為釀酒師監控發酵過程提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 葡萄原料

‘龍眼’葡萄產自懷來，行距2 m，株距0.8 m。

1.1.2 酵母選擇

釀酒酵母（S. cerevisiae）VL2，由Lamothe Abiet公司生產，經釀酒師長期驗證，具有低溫耐受性強、啟動發酵快的特點，適合‘龍眼’干白葡萄酒的釀造。

1.1.3 主要試劑

果膠酶（食品級），Laffort公司；氯化鈉（分析純）、偏亞硫酸鉀（食品級），國藥集團有限公司；甲醇（色譜純），北京迪科馬科技有限公司；3-辛醇（分析純），美國Sigma公司；FastDNA? Spin Kit for Soil DNA抽提試劑盒，美國MP Biomedicals公司；MiSeq Reagent Kit v3測序試劑盒，美國Illumina公司。

1.2 儀器與設備

7890B-5977A氣相色譜質譜聯用儀，Agilent公司；57328-u頂空固相微萃取纖維頭，Supelco公司；HPINNOWAX毛細管色譜柱（60 m×250 μm×0.25 μm），Agilent公司；Autosampler 2707高效液相色譜儀，Waters公司；Wine Scan FT 120 FOSS儀，FOSS公司；2720 thermal cycler PCR儀，美國Applied Biosystems公司；Illumina Miseq測序儀，美國Illumina公司。

1.3 試驗設計方法

試驗用10 t不銹鋼控溫發酵罐發酵，每罐9 t葡萄汁，設置3個平行處理。

發酵工藝流程：葡萄原料→穗選→破碎除梗→葡萄汁壓榨（果膠酶 15 g·t-1）→焦亞硫酸鉀處理（60 mg·L-1）→冷浸漬48 h→澄清汁→接種釀酒酵母（200 g·t-1）→控制發酵溫度12～13 ℃進行酒精發酵→發酵結束→分離、調硫→下膠→熱穩定試驗→冷穩定處理→過濾→干白葡萄酒。

葡萄汁壓榨、前處理和澄清：葡萄采收后，用氮氣保護氣囊壓榨機（2 t·h-1）壓榨獲得葡萄汁（總糖：178.93 g·L-1，總酸：9.2 g·L-1），壓榨過程中添加焦亞硫酸鉀（60 mg·L-1）和果膠酶（15 g·t-1）。壓榨出的葡萄汁在7～8 ℃下放置48 h后分離出澄清汁（C），取500 mL用于后續分析。

酵母活化及擴培：取5400 g活性干酵母，在38 ℃水浴條件下，加入10倍水（54 L，38 ℃）進行活化。活化后的活性干酵母利用葡萄澄清汁（10 ℃）進行擴培，從38 ℃開始按照每次6 ℃的梯度依次降溫，每次降溫后保持3～5 min，將溫度降至11～13 ℃后，等量接種于11～13 ℃葡萄汁中，48 h后，溫度控制在12～13 ℃發酵，每天保持早中晚測量溫度。

各處理每隔1 d取樣，至酒精發酵結束。取樣共8次，分別為第2天、第4天……第16天，記為L2、L4、L6、L8、L10、L12、L14、L16。在3個發酵罐上中下部取樣共500 mL，樣品經4 ℃離心（9900 r·min-1離心15 min），上清液用于理化指標和揮發性香氣分析。樣品收集后，保存于﹣80 ℃。至發酵液殘糖小于2 g·L-1時，結束取樣。

1.4 微生物群落測定方法

參考先前方法將發酵過程中樣品進行總DNA提取和檢測，對細菌16S rRNA基因的V3～V4區和真菌ITS rRNA基因的ITS區目的基因進行PCR擴增，3個平行樣本PCR產物混合，用2%瓊脂糖凝膠對PCR產物進行檢測；按AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒說明對回收產物提取純化，用微型熒光計進行檢測定量。采用邊合成邊測序的方法在Illumina公司Miseq PE300平臺上機進行高通量測序。

1.5 理化指標測定方法

總糖、總酸和酒精度：利用FOSS儀在Wine Scan FT 120從波數926～5012 cm-1進行透射掃描測定；pH采用pH計法測定；甲醇參照GB/T 15038—2016[14]利用高效氣相色譜儀測定。

1.6 揮發性香氣測定方法

GC條件：Agilent HP-INNOWax毛細管極性色譜柱（60 m×250 μm×0.25 μm），進樣口溫度設定為240 ℃，載氣為高純He（＞99.999%），流速為 1 mL·min-1，不分流模式；柱箱升溫程序如表1所示。

表1 GC柱箱升溫程序Table 1 GC column box warming procedure

MS條件： EI＋離子源，電子能量為70 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，溶劑延遲5 min，質譜質量掃描范圍45～350 u。

測定結果利用NIST14譜庫定性，篩選匹配度＞90%的香氣組分，頂空固相微萃取，利用3-辛醇進行內標法半定量，每個樣品重復3次。

1.7 結果統計分析

試驗結果用X±SD形式表示，使用SPSS 26軟件（SPSS，Inc.，USA）進行統計分析；繪圖采用Origin 2020（OriginLab Corporation，USA）軟件；發酵過程中微生物變化使用SIMCA 14.1（Umetrics AB，Sweden）進行正交偏最小二乘分析（OPLS）；通過R語言包進行Spearman相關性分析。

2 結果與分析

2.1 干白葡萄酒理化指標

‘龍眼’干白葡萄酒發酵結束及葡萄澄清汁基本理化指標如表2所示。發酵天數共計16 d，酒精發酵結束時葡萄酒中甲醇含量為41.17±1.45 mg·L-1，符合GB/T 15037—2006[15]規定的不超過250 mg·L-1的要求。

表2 ‘龍眼’干白葡萄酒理化指標Table 2 Physical and chemical indexes of 'Longyan' dry white wine

2.2 干白葡萄酒發酵過程中微生物群落變化分析

對8個樣本的16S rRNA基因V3～V4區進行測序，獲得518 942個高質量讀數，每個樣本平均8212個序列。去除低豐度和非細菌操作分類單位（OTU）后，通過OTU聚類（相似性97%）得到766個OTU。對于真菌，使用HTS生成720 231的高質量讀數，每個樣本平均47 742個序列，獲得350個OTU（相似性97%）。

由圖1可見發酵過程中的總體樣本相對豐度大于1%的優勢微生物有細菌屬20種、真菌屬6種，相對豐度小于1%的歸為其他屬。

圖1 ‘龍眼’干白葡萄酒發酵過程中主要細菌（左）和真菌（右）相對豐度變化的影響Figure 1 Relative abundance changes of major bacteria (Left) and fungi (Right) during 'Longyan' dry white wine

對于細菌，葡萄汁中相對豐度較高的為駒形氏桿菌屬Komagataeibacter（53.79%），其次是葡糖桿菌屬Gluconobacter（14.40%），二者在發酵中逐漸減少，發酵結束時的豐度分別為1.31%和0.60%。發酵過程中增加最快的是地芽孢桿菌屬Geobacillus，到第8天時豐度達到66.76%，之后逐漸減少，在第16天時又增加到54.06%；其次是泛菌屬Pantoea在第4天（59.95%）時顯著增加，之后又逐漸減少，第16天時降至2.28%；不動桿菌屬Acinetobacter在第2天的豐度猛增至47.03%，隨后又迅速降低。

對于真菌，葡萄汁中有孢圓酵母屬Torulaspora豐度最高，為82.86%；其次是未分類門的子囊菌g_unclassified_p_Ascomycota（2.64%），枝孢屬g_Cladosporium（1.92%）。而發酵過程中以接種的釀酒酵母占優勢。

2.3 干白葡萄酒發酵過程中揮發性香氣變化分析

‘龍眼’干白葡萄酒揮發性化合物含量如表3所示。共鑒定出28種揮發性香氣化合物，分為醇類、乙酸酯、脂肪酸乙酯、其他酯類、酸類、醛類、酮類、萜烯類和C13-降異戊二烯。‘龍眼’葡萄澄清汁中共鑒定出4種揮發性香氣，有C6醇類的正己醇、(E)-2-己烯-1-醇，醛類為己醛，酮類為3-辛酮。發酵結束時，‘龍眼’干白葡萄酒共鑒定出25種揮發性香氣，相對含量較高的為脂肪酸乙酯中的辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯及乙酸酯中的乙酸異戊酯、乙酸己酯，均高于最低閾值，是葡萄酒果香的主要來源。其中，除辛酸乙酯在發酵中逐漸增加，到第14天最高（14 498.14±1279.99 μg·L-1），發酵結束降低到10 247.03±957.75 μg·L-1，其余均為發酵過程中逐漸增加；其他酯類中辛酸異戊酯帶有菠蘿、椰子和奶油香，己酸異戊酯與癸酸異戊酯均帶有果香和甜味，在發酵過程中逐漸增加；醇類中相對含量最高的為異戊醇，其次為苯乙醇，發酵過程中乙酰轉移酶催化高級醇酯化產生乙酸酯；脂肪酸含量最高的是辛酸，其次是癸酸和己酸，來源于脂質代謝和長鏈脂肪酸分解[16]，均逐漸增加到第10天最高后減少。萜烯類是β-石竹烯和4-萜烯醇分別在發酵第10天較高，第4天開始檢測到，并逐漸增加。C13-降異戊二烯中的β-大馬士酮在發酵第2天被檢測到，以后逐漸增加。

表3 ‘龍眼’干白葡萄酒揮發性化合物相對含量Table 3 Volatile compounds relative content in 'Longyan' dry white wine

2.4 干白葡萄酒發酵過程中微生物群落與揮發性香氣化合物變化相關性

如圖2所示，以鑒定出的28種揮發性化合物為橫坐標，以相對含量＞1細菌和真菌為縱坐標進行正交偏最小二乘分析（OPLS），得到VIP＞1（R2＞0.5，Q2＞0.5）的核心微生物細菌屬11種，真菌屬2種。如圖3所示，通過AI進行可視化得到OPLS分析VIP＞1的核心微生物與28種揮發香氣的Spearman相關性（|R|＞0.7；P＜0.05）。

圖2 ‘龍眼’干白葡萄酒發酵過程中微生物群與揮發性化合物的相關性VIP分析Figure 2 VIP correlation analyses between microflora and volatile compounds of 'Longyan' dry white wine fermentation

如圖3所示細菌中有5個屬：駒形桿菌屬、葡萄糖桿菌屬、醋酸桿菌屬、甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬與葡萄汁中品種香正己醇、(E)-2-己烯-1-醇和己醛呈顯著正相關，與發酵過程中產生的香氣呈負相關；而地芽孢桿菌屬與乙酸癸酯、乙酸苯乙酯、4-萜烯醇和β-大馬士革酮；乙酸己酯、己酸乙酯、4-萜烯醇呈極顯著正相關；乳酸桿菌屬（Lactobacillus）與4-萜烯醇和β-大馬士革酮；己酸、乙酸癸酯、乙酸苯乙酯、己酸乙酯和癸酸異戊酯呈極顯著正相關；嗜熱厭氧桿菌屬與己酸、4-萜烯醇和β-大馬士革酮；乙酸癸酯、乙酸苯乙酯、己酸乙酯和癸酸異戊酯呈極顯著正相關；乳球菌屬與乙酸癸酯呈極顯著正相關。

圖3 ‘龍眼’干白葡萄酒發酵過程中核心微生物（VIP＞1）和揮發性化合物相關性熱圖Figure 3 Correlation heatmap between core microbiota (VIP＞1) and volatile compounds during 'Longyan' dry white wine fermentation

真菌中釀酒酵母與發酵香呈正相關，而非釀酒酵母有孢圓酵母屬與葡萄汁中品種香(E)-2-己烯-1-醇和己醛呈顯著正相關。

3 討論和結論

本研究用高通量16s rRNA及ITS測序技術和HSSPME-GC/MS，對‘龍眼’干白葡萄酒發酵過程中微生物群落和揮發性成分變化進行監測。

共鑒定出28種揮發性香氣，包括醇類3種、乙酸酯7種、脂肪酸乙酯6種、其他酯類3種、酸類4種、醛類1種、酮類1種、萜烯類2種和C13-降異戊二烯1種，相對含量最高的為脂肪酸乙酯中的辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯及乙酸酯中的乙酸異戊酯、乙酸己酯。值得注意的是，萜類化合物β-石竹烯（倍半萜）是薄荷中的主要香氣[23]，具有青草和木質的味道，在葡萄酒中未見報道；4-萜烯醇（單萜）化合物常存在于葡萄表皮和葡萄藤中，一些釀造工藝壓榨、浸漬，以及酶、細菌、酵母的參與會影響其在葡萄酒中的含量[24]。β-大馬士酮（C13-降異戊二烯，倍半萜酮）是胡蘿卜素的降解產物，對葡萄酒有重要影響[25]，在葡萄酒中的閾值極低，通常為0.05 μg·L-1，可以直接賦予葡萄酒花香、蜂蜜和水果的香味[26]，或協同改變其他水果的香味[27]。本研究初步明確了‘龍眼’干白葡萄酒發酵過程中的揮發性香氣，未來可以通過感官組學中GC-O、香氣提取稀釋、香氣遺漏和重組等技術進一步明確具有代表性的‘龍眼’干白的典型香氣。

本試驗檢測到的相對含量＞1%的細菌屬有20種，真菌屬有6種。通過OPLS分析初步確定了11種細菌和5種真菌為VIP＞1的核心微生物。通過Spearman相關性分析得出，其中的5種細菌和1種真菌與葡萄汁中品種香正己醇、(E)-2-己烯-1-醇和己醛呈顯著正相關，4種細菌和1種真菌即釀酒酵母屬（Saccharomyces）與發酵過程中的部分發酵香呈極顯著正相關，特別是地芽孢桿菌屬（Geobacillus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和嗜熱厭氧桿菌屬（Thermoanaerobacterium）均與乙酸癸酯、乙酸苯乙酯、4-萜烯醇、β-大馬士革酮、乙酸苯乙酯和癸酸異戊酯等呈極顯著正相關。已有研究表明，地芽孢桿菌屬（Geobacillus）的許多脂肪酶能在極端溫度和pH值下存在，并具有酯合成潛力[28]。與蘋果酸-乳酸發酵相關的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）具有糖苷酶和酯酶活性，從而進一步改善葡萄酒的風味[29]，因此地芽孢桿菌屬（Geobacillus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和嗜熱厭氧桿菌屬（Thermoanaerobacterium）可能是與發酵過程中揮發性香氣產生相關的核心功能微生物，共同促進了‘龍眼’干白葡萄酒發酵過程中復雜揮發性香氣的形成。在以往的研究中已有高通量技術監測發酵過程中微生物變化及與揮發性香氣相關性研究[11-13]，從而初步確定對揮發性香氣有貢獻的核心功能微生物，但工業化生產中葡萄酒相關研究較少。綜上，本研究初步明確了‘龍眼’干白葡萄酒發酵過程中的核心微生物、核心功能微生物及其與揮發性香氣的相關性。關于微生物如何代謝仍需要進行轉錄組學和代謝組學的深入研究，這些微生物的食品安全性仍待長期驗證。