艾葉油GC-FP 研究

★ 黎艷剛 李麗云 孫文強 周云龍 朱海 丁江生（云南省藥物研究所/云南省中藥和民族藥新藥創制企業重點實驗室 昆明 650111）

中藥指紋圖譜是從物質基礎角度出發，運用現代分析測試技術對不同種類或者產地的中藥材經預處理后通過一定的構建辦法得到的能體現該種藥材質量的色譜或光譜圖，是一種綜合的、可量化的鑒定手段。作為一種能整體反映中藥內部成分的新技術，中藥指紋圖譜是目前公認的較為有效的中藥質量控制技術，可作為鑒別中藥真偽和優劣的依據［1］。

艾葉是我國傳統中藥材，為菊科植物艾的干燥葉，夏季花未開時采摘，除去雜質，曬干［2］；最早在《詩經》中就有記載，主產于河南、河北、安徽、湖北、山東、江西等地［3］。其化學成分主要有揮發油、黃酮類、三萜類、鞣質及微量元素等［4］，具有溫經止血、散寒止痛等作用［2］，其中揮發油已成為研究的熱點，主要成分有α-蒎烯、β-側柏酮、樟腦、反式石竹烯等［5］。目前已應用于藥品、食品、保健品等領域，開發前景廣闊。

艾葉油為菊科植物艾葉經水蒸氣蒸餾提取出來的揮發油，具有抗菌、消炎、平喘、祛痰等活性［6-7］。艾葉油化學成分復雜，且各成分含量存在較大差異［8］，2020 年版《中華人民共和國藥典》艾葉藥材的含量測定只控制了桉油精和龍腦的含量，1977 年版《中華人民共和國藥典》艾葉油的質量標準沿用至今，該質量標準未對含量進行控制，且現有文獻未見艾葉油氣相色譜指紋圖譜的報道。故采用GC 法建立了艾葉油氣相色譜指紋圖譜的研究方法，以更全面、準確、有效地控制艾葉油的質量。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 6890N 氣 相 色 譜 儀（配 有 自 動 進樣器、柱溫箱、FID 檢測器和Agilent 色譜工作站，美國Agilent 公司）；SPB-3 全自動空氣發生器（北京中惠普分析技術研究所）；載氣為高純氮氣（99.999%）；燃氣為高純氫氣（99.999%）；EX125ZH 電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；2012 版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（V2.0）。

1.2 試藥

α-蒎烯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110897-201803，純度為99.90%）；桉油精對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110788-201707，純度為100.00%）；右旋龍腦對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110688-201602，純度為99.60%）；β-石竹烯對照品（PaNPH 公司，批號為FC040301，純度為94.90%）；艾葉油樣品來源于不同的廠家及實驗室提取，見表1；正己烷為分析純。

1.3 色譜條件

BD-1 毛細管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；進樣口溫度280 ℃；FID 檢測器溫度280 ℃；柱溫40 ℃，保持5 min，以1.5 ℃/min 升至70 ℃，再以5 ℃/min 升至200 ℃，保持5 min；流速：1 mL/min；進樣量：1 μL；分流比為10∶1。

1.4 對照品溶液的制備

分別稱取適量的α-蒎烯、桉油精、右旋龍腦、β-石竹烯，用正己烷制成混合對照品溶液。

1.5 自提揮發油的制備

按2020 年版《中華人民共和國藥典》四部（2204 揮發油測定方法）用法進行操作。

1.6 供試品溶液的制備

精密稱取，艾葉油樣品50 mg，置50 mL 量瓶中，加正己烷至刻度線搖勻，濾過，取其續濾液作為供試品溶液。

1.7 方法學考察

1.7.1 穩定性實驗 取同一樣品（編號S1），按“1.6”項下方法制備供試品溶液1份，分別在0，2，4，6，8，10，12，18 和24 h 按“1.3”的色譜條件進樣檢測。

1.7.2 精密度實驗 取同一樣品（編號S1），按“1.6”項下方法制備供試品溶液1 份，按“1.3”的色譜條件連續測定6 次。

1.7.3 重復性實驗 取同一樣品（編號S1），按“1.6”項下方法制備供試品溶液6 份，按“1.3”的色譜條件進行測定。

1.8 供試品測定

取11 批不同來源的艾葉油，按“1.6”項下方法制備供試品溶液，按“1.3”的色譜條件進行測定。

2 結果

2.1 穩定性實驗

以桉油精的保留時間為參照，計算各共有峰的相對保留時間，各共有峰相對保留時間RSD均小于0.5%；以桉油精的峰面積為參照，計算各共有峰的相對峰面積，各共有峰相對峰面積RSD均小于3.0%，表明樣品溶液在24 h 內穩定。

2.2 精密度實驗

以桉油精的保留時間為參照，計算各共有峰的相對保留時間，各共有峰相對保留時間RSD均小于0.5%；以桉油精的峰面積為參照，計算各共有峰的相對峰面積，各共有峰相對峰面積RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.3 重復性實驗

以桉油精的保留時間為參照，計算各共有峰的相對保留時間，各共有峰相對保留時間RSD均小于0.5%；以桉油精的峰面積為參照，計算各共有峰的相對峰面積，各共有峰相對峰面積RSD均小于3.0%，表明具有較好的重現性。

2.4 艾葉油指紋圖譜的建立與分析

采用11 批不同來源的艾葉油建立艾葉油的GC 指紋圖譜，見圖1。以桉油精（S）為參照峰，采用2012 版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（V2.0）處理數據，經多點校正，以中位數法生成對照指紋圖譜，并計算各艾葉油樣品圖譜與對照指紋圖譜的相似度。結果11 批艾葉油有17 個共有峰，其指紋圖譜匹配圖見圖1B，經過與對照品對比，確認了4 個特征指紋峰，即共有峰1 為α-蒎烯、共有峰6（S）為桉油精、共有峰8 為右旋龍腦、共有峰13 為β-石竹烯。見表1。

表1 艾葉油來源信息及GC相似度計算結果

江西百草藥業生產的艾葉油和康圣堂生產的艾葉油GC 指紋圖譜與對照指紋圖譜之間的相似度均較高，吉水縣金海生產的艾葉油與實驗室自提的艾葉油相似度較近且與對照指紋圖譜之間的相似度較低。見圖1。

圖1 艾葉油GC指紋圖譜

2.5 艾葉油樣品聚類分析

以GC 指紋圖譜共有峰相對峰面積作為特征指標，采用SPSS 統計軟件對艾葉油進行聚類分析，采用組間均連法，以歐氏距離為測度進行分類處理，聚類譜系見圖2。從聚類結果可知S1，S3，S2歸為第一類（百草藥業艾葉油）；S6，S7，S8，S5歸為第二類（康盛堂艾葉油）；S10，S11，S4，S9歸為第三類（金海及自提艾葉油）。

圖2 艾葉油樣品聚類分析樹狀圖

3 結論

采用國家藥典委員會的相似度評價系統計算的相似程度和SPSS 系統軟件進行的聚類分析結果其相似性較強，都能將金海及自提的區分開，但也有著一定的區別，結合2 種分析方法，發揮各自優勢，能有效地區分不同來源的艾葉油，為臨床用藥提供科學參考依據。

4 討論

艾葉油中含有α-蒎烯、桉油精、側柏酮、右旋龍腦、β-石竹烯等揮發性成分，2020 年版《中華人民共和國藥典》艾葉藥材質量標準中含量測定采用桉油精和龍腦為其質量控制指標。桉油精為所有艾葉油中所共有，其質量穩定，將其作為內參照峰，所得相似度結果良好，各特征色譜峰均能良好對齊。

《中華人民共和國藥典》記載艾葉具有小毒［2］，據研究表明β-側柏酮［9］是有毒性的一類成分，出峰時間為29.26 min，樣品S1、S2、S3 號為未檢測到β-側柏酮，推測其原因：一是可能艾葉原藥材中不含β-側柏酮，二是艾葉油的提取廠家對艾葉油做了相應的減毒處理。其他廠家及自提艾葉油中β-側柏酮含量較低且高低不同，說明不同廠家及自提艾葉油中的β-側柏酮的含量與艾葉生長條件、采收時期、干燥條件、儲藏條件、儲存時間等都有一定關系。

本研究所建立的艾葉油GC 指紋圖譜研究方法操作簡單、重現性好且穩定可靠。結合2012 版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（V2.0）和SPSS軟件聚類分析處理數據，能有效判別不同廠家及自提艾葉油之間的差異，能初步區別并推測艾葉油的生產廠家，為中醫臨床用藥提供科學依據。此外，本研究所建立的檢測方法還可以用于艾葉油中α-蒎烯、桉油精、右旋龍腦、β-石竹烯4 個主要活性成分的含量測定，為艾葉油的質量評價提供了參考。