碳源、氮源和磷源對黃芩細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

楊 靜 陳 娜 崔曉雪

天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境與化工學(xué)院 天津 300042

黃芩是我國傳統(tǒng)中藥材之一，其次生代謝產(chǎn)物含量黃芩苷等具有清熱燥濕、消炎、抗病毒和抗菌等多種病理效用[1]。利用懸浮培養(yǎng)技術(shù)可以獲得高質(zhì)量、高產(chǎn)量的黃芩替代品，具有次生代謝產(chǎn)物含量高、抗氧化活性較強(qiáng)的優(yōu)點。近年來，國內(nèi)對于植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究有較多報道。黃燕芬[2]等研究了碳氮磷營養(yǎng)對百蕊草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長的影響。曲丹[3]考察了碳源對迷迭香懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長、迷迭香酸積累及抗氧化酶活性的影響。本文通過考察黃芩細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程的碳源、氮源和磷源對黃芩細(xì)胞生長和黃芩苷產(chǎn)物合成的影響，為大規(guī)模利用黃芩懸浮培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)生產(chǎn)黃芩苷提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

黃芩種子購自河北省安國市藥材市場，黃芩苷對照品購自中國藥品生物制品檢定所；化學(xué)試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

TCYA ZYSA0351型搖床，202型電熱恒溫干燥箱，BCN-1360型超凈工作臺，Satorius BS 2202S型電子天平，UV-7500紫外分光光度計，HPG-280B強(qiáng)光照培養(yǎng)箱等。

1.3 方法

1.3.1 黃芩無菌苗的獲得

取飽滿的黃芩種子用75%的乙醇浸泡1min，用無菌水沖洗3次，在2%的次氯酸鈉溶液中進(jìn)行表面消毒20min，再用無菌水沖洗5次。

將消毒滅菌的種子接種于添加0.2mg/L6-BA的MS培養(yǎng)基上，pH5.8，光照16h培養(yǎng)，4～5d種子萌發(fā)，20d后可得長勢良好的試管苗。

1.3.2 黃芩愈傷組織的誘導(dǎo)

取黃芩試管苗幼嫩莖段，用自來水沖洗干凈，75%的乙醇消毒30s，無菌水沖洗3次，切成0.5cm左右長的小段，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為MS培養(yǎng)基，附加有1.0mg/L6-BA、2.0mg/LNAA、3%蔗糖、1%瓊脂，pH5.8，培養(yǎng)條件為25±1℃，暗培養(yǎng)。培養(yǎng)大約6周后可得愈傷組織。

1.3.3 黃芩愈傷組織的增殖

挑選生長良好疏松的愈傷組織稱重后進(jìn)行繼代培養(yǎng)，其培養(yǎng)條件同誘導(dǎo)培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)3次后獲得生長穩(wěn)定、質(zhì)地疏松的黃芩愈傷組織。

1.3.4 不同碳源種類對黃芩細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

將愈傷組織2g接種到250mL三角瓶中培養(yǎng)，三角瓶內(nèi)含50mL液體培養(yǎng)基(MS+1.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA)，培養(yǎng)基中分別添加3%蔗糖、3%果糖、3%葡萄糖、1.5%蔗糖+1.5%果糖，1.5%蔗糖+1.5%葡萄糖，1.5%果糖+1.5%葡萄糖。培養(yǎng)基pH5.8，搖床轉(zhuǎn)速120r/min，每組重復(fù)3～4瓶。

1.3.5 不同蔗糖質(zhì)量濃度對黃芩細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

愈傷組織接種到1.3.4所述培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加2%、3%、4%、5%、6%的蔗糖。培養(yǎng)基的pH和搖床轉(zhuǎn)速如上，每組重復(fù)3～4瓶。培養(yǎng)20天后，分別測定培養(yǎng)過程中黃芩細(xì)胞懸浮系的生長環(huán)境、生物量及黃芩苷含量，重復(fù)試驗3次。

1.3.6 氮源對黃芩細(xì)胞培養(yǎng)的影響

愈傷組織接種到1.3.4所述培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加3%的蔗糖，原MS培養(yǎng)基中的NH4NO3用(NH4)2SO4代替，即KNO3提供硝態(tài)氮和(NH4)2SO4和銨態(tài)氮。設(shè)計MS培養(yǎng)基中其他基本成分及激素配比不變，固定氮源總量為60mmol·L-1改變，銨態(tài)氮與硝態(tài)氮的比例分別為0∶60、10∶50、20∶40、30∶30、40∶20、50∶10和60∶0。培養(yǎng)基的pH和搖床轉(zhuǎn)速如上，每組重復(fù)3～4瓶。

1.3.7 磷源對黃芩細(xì)胞培養(yǎng)的影響

愈傷組織接種到1.3.4所述培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加3%的蔗糖，同時向培養(yǎng)基中添加基本MS培養(yǎng)基1/2、1倍、2倍、4倍、8倍的KH2PO4。培養(yǎng)基的pH和搖床轉(zhuǎn)速如上，每組重復(fù)3～4瓶。

1.3.8 生物量的測定

取懸浮細(xì)胞液置于離心管中，轉(zhuǎn)速8000r/min，離心15min，棄去上清液，用蒸餾水洗滌細(xì)胞2～3次，棄去上清液，稱得到沉淀細(xì)胞質(zhì)量，即為細(xì)胞鮮重，置于烘箱中60℃干燥7～8h以至恒重，稱其質(zhì)量為細(xì)胞干重。干重增殖倍數(shù)=(收獲時細(xì)胞干重-接種時細(xì)胞干重)/接種時細(xì)胞干重。

1.3.9 黃芩苷含量測定

1.3.9.1 樣品溶液的制備

黃芩苷的提取在參照張進(jìn)杰等[4]的方法，做出改進(jìn)，將黃芪細(xì)胞培養(yǎng)物50℃下烘干至恒重，置于研缽內(nèi)，研磨成粉末，取黃芩干細(xì)胞粉用95%乙醇超聲20min提取兩次，每次干細(xì)胞∶乙醇為1∶100(W∶V)；將兩次混合提取液減壓濃縮至浸膏狀，用95%乙醇溶解定容至50mL備用。

1.3.9.2 黃芩苷含量測定

將制備好的溶液用紫外可見分光光度計在最大吸收波長278nm處測定吸光度A，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算培養(yǎng)液中的黃芩苷含量。另取95%的分析乙醇作空白。

1.3.9.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

精密稱取0.0100g黃芩標(biāo)準(zhǔn)品，配制成100μg/mL黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品的乙醇溶液，用移液管分別移取0.5、1、1.5、2、2.5mL于5個10mL的容量瓶中，用95%的分析乙醇定容至刻度，充分搖勻，放置10min。以空白乙醇溶液為參比，在278nm處用紫外分光光度計測定其吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)、黃芩苷含量C(ug/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，曲線方程為A=0.5117C+0.0576，相關(guān)系數(shù)R2=0.9997。

圖1 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類碳源對黃芩細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

從表1中可以看出3%蔗糖為碳源時明顯有利于黃芩細(xì)胞的增殖，而以3%果糖為碳源時黃芩細(xì)胞合成的黃芩苷的含量達(dá)到了最高。綜合考慮細(xì)胞生長和經(jīng)濟(jì)成本，選用蔗糖作為碳源。

表1 不同碳源對黃芩細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

2.2 不同蔗糖濃度對黃芩細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

2.2.1 不同蔗糖濃度對黃芩細(xì)胞生長的影響

圖2 不同蔗糖濃度對黃芩細(xì)胞懸浮培養(yǎng)影響

如圖2所示，不同濃度蔗糖的培養(yǎng)條件下，隨培養(yǎng)時間增長，細(xì)胞干重逐漸增加，到20天的時候達(dá)到最大值，然后開始下降。添加3%蔗糖的培養(yǎng)基中細(xì)胞干重增長率最高，達(dá)到5.49。蔗糖濃度4%和5%相比，蔗糖濃度5%的黃芩細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的生物量積累更穩(wěn)定且在第20天時達(dá)到峰值。當(dāng)添加蔗糖為6%時，培養(yǎng)20天時細(xì)胞干重增加較明顯，之后細(xì)胞干重下降不明顯，原因是培養(yǎng)基中仍有未消耗殆盡蔗糖。綜合分析，黃芩細(xì)胞培養(yǎng)最適合的蔗糖添加量是3%，當(dāng)培養(yǎng)20天時可以得到最大干重產(chǎn)量。

2.2.2不同蔗糖濃度對黃芪苷合成的影響

圖3 不同蔗糖濃度對黃芩苷合成的影響

圖3為培養(yǎng)過程中黃芩苷合成的動力學(xué)曲線，結(jié)合圖2可以看出在培養(yǎng)周期內(nèi)隨著黃芩細(xì)胞干重增加黃芩苷的合成也在逐漸增加，即黃芩細(xì)胞生長和次生代謝產(chǎn)物的合成存在一定的相關(guān)性。在20天的生長周期中，五個濃度的蔗糖細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的黃芩苷合成趨勢是先緩慢穩(wěn)定增加，然后迅速生長，直到生長周期的最后一天達(dá)到最高。在培養(yǎng)20天時，蔗糖濃度為3%的黃芩細(xì)胞懸浮體系的黃芩苷含量達(dá)到最高。

2.3 氮源對黃芩細(xì)胞培養(yǎng)的影響

表2 氮源對黃芩細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

由表2可見不同的NH4+/NO3-對細(xì)胞生長量和黃芩苷成分含量均具有顯著的影響。較高比例的硝態(tài)氮有利于細(xì)胞生長量的積累，培養(yǎng)基里全部是硝態(tài)氮時，細(xì)胞鮮質(zhì)量和干質(zhì)量達(dá)到最大值，但此時黃芩苷含量相對較低。繼續(xù)增大NH4+/NO3-的比值，黃芩細(xì)胞鮮重和干重均在下降，當(dāng)培養(yǎng)液中全部是NH4+時，黃芩細(xì)胞幾乎停止生長，而高濃度的硝態(tài)氮則更有利于黃芩類成分積累。當(dāng)銨態(tài)氮為唯一氮源時細(xì)胞內(nèi)黃芩苷含量達(dá)到最大值47.29μg/g。考慮細(xì)胞的生長和黃芩苷的合成，當(dāng)NH4+/NO3-為30∶30時，細(xì)胞生長較好，黃芩苷含量較高。

2.4 磷源對黃芩細(xì)胞培養(yǎng)的影響

表3 磷源對黃芩細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

從表3中可以看到，KH2PO4的濃度的變化會影響黃芩細(xì)胞生長和黃芩苷的合成。當(dāng)KH2PO4濃度增加到基本培養(yǎng)基1/2時，黃芩苷的合成量達(dá)到了最高。當(dāng)KH2PO4濃度繼續(xù)升高時，黃芩苷的含量開始下降，可見高濃的KH2PO4會抑制黃芩苷的合成實驗表明，向培養(yǎng)基中添加基本MS培養(yǎng)基1/2倍的KH2PO4時，黃芩細(xì)胞生長量和黃芩苷合成達(dá)到最大。

3 結(jié)論

植物組織培養(yǎng)過程中一般是添加蔗糖、葡萄糖或果糖，其中以蔗糖最常用。岳建華等[5]采用蔗糖、葡萄糖和麥芽糖等碳源對早花百子蓮愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)，愈傷組織誘導(dǎo)率分別為86.00%、72.00%和59.67%。在研究秦艽細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，30g/L的蔗糖濃度有利于秦艽懸浮細(xì)胞的生長及龍膽苦苷積累[6]。可見，對于不同的植物，適合其生長和次生代謝產(chǎn)物積累的碳源種類和濃度也有較大差異。蔗糖除了為細(xì)胞懸浮系提供能量之外，還能夠誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)行再分化，在植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基中還具有滲透調(diào)節(jié)劑的作用。

氮植物細(xì)胞生長、發(fā)育及次生代謝物產(chǎn)生必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，對懸浮細(xì)胞生長具有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮比例為5∶1時，甘草細(xì)胞獲最大生物量，以銨態(tài)氮為氮源，黃酮類物質(zhì)積累量最高[7]。高比例下的硝態(tài)氮有利于細(xì)胞生物量積累，高比例下銨態(tài)氮則有利于黃芩苷的合成，而過量銨態(tài)氮對細(xì)胞生長有抑制作用。這可能是培養(yǎng)基中較低濃度的銨鹽進(jìn)入細(xì)胞會被及時代謝掉，銨態(tài)氮過量時會蓄積傷害細(xì)胞，從而影響細(xì)胞的生長。

磷是植物體內(nèi)的核酸、核蛋白、磷脂和多種酶的組成成分，對次生代謝物的生物合成也有非常重要的作用。在太子參不定根培養(yǎng)中，低磷酸鹽濃度有利于生物量的產(chǎn)生，而高磷酸鹽濃度則能顯著提高太子參不定根培養(yǎng)中多糖的含量[8]。