DNaseⅠ與Nd：YAP激光聯合應用對根管內糞腸球菌生物膜清除作用的影響

葉靜，劉青，溫特，杜瑞，王園，馬賁，尼娜△

根管治療的主要目的是維持或促進根尖周組織的愈合［1］。治療效果主要取決于機械預備、化學預備及根管充填［2］。然而，由于根管形態較為復雜，機械預備清理到的根管壁面積不超過總面積的35%［1］。另外，根管系統內的細菌以生物膜形式存在，其耐藥性是浮游細菌100～1 000 倍，造成管內感染物清除相對困難［3］，機械預備配合化學預備最終清除的細菌僅達到50%～70%［4］。化學預備在感染根管治療中尤為重要，目前臨床常用的根管沖洗液雖種類繁多，但均不能完全清除感染根管中的糞腸球菌（E.f）生物膜［5］。自Whitchurch 等［6］發現脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）能夠通過酶促降解細胞外基質細胞外DNA（eDNA）從而離散細菌生物膜以來，許多研究通過破壞生物膜細胞外基質來提高藥物對生物膜的清除效果［7］。激光活化蕩洗技術被廣泛應用于去除根管內生物膜。Nd：YAP激光通過活化根管沖洗劑后具有明顯的抑菌作用及去除玷污層的能力［8］，但DNaseⅠ與激光聯合用于根管沖洗的效果尚不明確。本研究通過比較分析不同沖洗配伍方案，觀察根管內E.f生物膜的去除情況，為DNaseⅠ與激光聯合應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 ATCC29212E.f購自美國模式菌種保藏中心。Nd：YAP 激光（Lokki，LONBAL 公司）；次氯酸鈉［NaOCl，朗力生物醫藥（武漢）有限公司］；DNaseⅠ（10 U/mL，pH=6．8，AMPD1-1KT，美國Sigma-Aldrich 公司）；SYTO-9 熒光染色劑（美國賽默飛世爾科技公司）；PI 熒光染色劑、腦心浸液肉湯（BHI）培養基（北京索萊寶科技有限公司）；KS160A-2型CO2培養箱（上海冠森生物科技有限公司）；掃描電子顯微鏡（SEM，日本日立公司）；Axio-Imager_LSM-800型激光共聚焦顯微鏡（CLSM，德國卡爾蔡司公司）；96 孔板（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.2E.f感染模型建立 收集2021年5月—2022年2月在天津市天津醫院口腔科因正畸或牙周疾病而拔除的30顆前磨牙和磨牙。本研究經天津市天津醫院醫學倫理委員會批準（批準號：2021醫倫理103）。納入標準：離體牙發育完全，牙體完整，無裂紋，無齲壞，無充填物。將存于0．1%麝香草酚中的離體磨牙制備成2 mm×2 mm×1 mm（長×寬×高）的牙本質片，使用砂紙打磨拋光，共制備30 片。隨后將其置于3%次氯酸鈉（NaOCl）溶液中浸泡5 min，無菌去離子水沖洗，再浸泡于17%EDTA溶液中5 min，無菌去離子水沖洗。高溫高壓滅菌30 min 后，采用隨機數字表法取2 片置于BHI 液體培養基中，37 ℃微需氧條件下（5%O2、85%N2、10%CO2）靜置培養24 h，觀察培養基中有無沉淀；并將其置于BHI 固體培養基上劃線后培養24 h觀察有無菌落，從而檢測牙本質片表面滅菌效果。若存在細菌需重新高溫高壓滅菌，在確定無殘余活細菌后，將牙本質片置于無菌生理鹽水中，4 ℃冰箱保存備用。

將E.f單菌落接種于新鮮配制的BHI 液體培養基中，37 ℃微需氧環境下靜置培養，使用分光光度法監測細菌處于對數生長期（OD600nm=0．5，細菌濃度約1×108CFU/mL）時，取E.f液用BHI液稀釋，調整菌液密度為1×107CFU/mL。將剩余28 片無菌牙本質片分別放入96 孔板中，將上述稀釋好菌液加入96孔板。37 ℃微需氧條件下靜置培養48 h，完成牙本質片表面E.f單菌種感染模型的建立，見圖1。

1.3 SEM 觀察感染模型建立情況 采用隨機數字表法取3個樣本固定于4%多聚甲醛24 h，PBS沖洗，采用乙醇逐級將樣本脫水。真空下離子濺射儀噴金，采用SEM觀察。

Fig．1 Establishment of a single E.f infection model on dentin discs圖1 牙本質片表面糞腸球菌單菌種感染模型的建立

1.4 實驗分組及處理 將剩余25 個培養48 h 的E.f生物膜樣本采用PBS 沖洗去除游離菌后按照隨機數字表法分為5組，每組5 個樣本。A 組：2 mL PBS 輕輕沖洗去除游離菌，0．5%NaOCl 沖洗15 s；B 組：2 mL PBS 輕輕沖洗去除游離菌，0．5%NaOCl 沖洗聯合Nd：YAP 激光照射15 s；C 組：1 mL PBS輕輕沖洗去除游離菌，1 mL DNaseⅠ溶液（10 U/mL，pH=6．8）沖洗，0．5%NaOCl 沖洗15 s；D 組：1 mL PBS 輕輕沖洗去除游離菌，1 mL DNaseⅠ溶液（10 U/mL）沖洗，0．5%NaOCl 沖洗聯合Nd：YAP 激光照射15 s；E 組：1 mL PBS 輕輕沖洗去除游離菌，生理鹽水沖洗15 s。Nd：YAP 激光照射根管時統一選擇200 μm的光纖，平均功率為1．8 W，頻率5 Hz。

1.5 CLSM 觀察牙本質表面E.f黏附情況 處理后各組避光條件下加入SYTO-9/PI 混合液1 mL，染色15 min 后用1 mL無菌去離子水輕輕沖洗，CLSM應用2個通道觀察，PI紅色通道發射波長619 nm和激發波長559 nm，SYTO-9綠色通道發射波長520 nm 和激發波長448 nm。25 個樣本均隨機取3 個視野進行觀察。利用Imaris v7．2．3軟件對所獲取的生物膜樣本斷層掃描圖像進行三維重建，以熒光強度為篩選標準進行分析，計數綠色熒光量即為活細菌量。

1.6 統計學方法 采用SPSS 25．0 軟件進行數據分析，非正態分布的計量資料采用M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間多重比較采用Bonferonni 法。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 牙本質表面感染模型建立情況 SEM 觀察可見牙本質表面的小管口開放，E.f黏附聚集在牙本質表面，并見到牙本質小管深層內細菌黏附，見圖2。

Fig．2 SEM images of dentin surface infection model圖2 牙本質表面感染模型的SEM圖像

2.2 牙本質表面糞腸球菌黏附情況 CLSM觀察可見A、B、C組CLSM圖像中綠色熒光的活細菌散在分布于牙本質表面，D 組可見較少量的綠色熒光，E 組綠色熒光的活細菌覆蓋全部樣本表面。見圖3。

2.3 各組活細菌量計數比較 A、B、C、D、E 組菌量（單位：×104/mm2）分別為38．33（32．18，52．23）、13．52（7．14，20．01）、3．79（1．50，7．50）、0．79（0．08，2．28）、122．76（99．14，156．15），組間比較差異有統計學意義（χ2=22．206，P＜0．01）。其中D 組中菌量明顯小于A組和E組，C組菌量明顯小于E組（P＜0．01），余組間活細菌量計數差異無統計學意義。

3 討論

感染根管系統內的生物膜為多菌種生物膜［5］。在持續性或者繼發性根管感染中E.f檢出率為29%～77%，其為革蘭陽性兼性厭氧菌［9-10］。在根管充填后E.f可以在無營養的根管內維持低代謝狀態存活；當環境改變，營養良好時其又將引起感染的復發［3］。此外，E.f在在10～45 ℃下均能夠生長，且E.f具有耐藥性，特別是黏附聚集形成生物膜后。不同研究中E.f黏附并形成生物膜的時間均不一致。相關報道建立E.f生物膜所需的培養時間為幾小時、24 h、2周或3 周［1，3］。本研究在預實驗中牙本質表面培養E.f在培養48 h時SEM直觀清晰觀察到E.f黏附聚集，證實成功建立了牙本質表面感染模型。Nd：YAP激光為波長1 341 nm 的最新激光類型，具有良好的熱效應、爆破效應、空化效應以及負壓效應，可以徹底對根管系統進行蕩洗，甚至是側支根管、根尖分歧、峽部這些區域［8，11］。Liu 等［3］研究Nd：YAP 激光活化蕩洗技術對于根管內E.f生物膜的影響，發現激光組較僅應用5．25%NaOCl 組更能有效清除根管壁和牙本質小管內的E.f。目前臨床中還常見應用Er：YAG激光輔助根管沖洗［12］。Golob 等［13］研究結果顯示Er：YAG配合5%NaOCl能夠有效去除E.f生物膜。本研究應用Nd：YAP激光配合0．5%NaOCl處理樣本后E.f細菌量與只采用0．5%NaOCl 進行傳統沖洗組差異無統計學意義。

DNaseⅠ是一種特異性的DNA 水解酶，能夠在磷酸二酯鍵處切割單鏈或雙鏈DNA［14］。eDNA是細菌生物膜細胞外多聚物基質的成分，其在細菌黏附、聚集以及生物膜形成、成熟和穩定中都起到重要的作用，并且在細菌耐受抗菌劑和逃避宿主免疫中也起到重要的作用［14-16］。已有研究證明，DNaseⅠ可通過降解eDNA 來減少E.f的黏附和生物膜的形成［7］。Ramaraj 等［10］研究DNaseⅠ與蜂毒素聯合應用對于E.f生物膜的影響，結果顯示DNaseⅠ提高了蜂毒素抗生物的作用，聯合應用使生物膜對NaOCl 敏感性增加，降低了NaOCl 的使用濃度。Yu 等［17］研究表明，0．5%NaOCl 聯合DNaseⅠ處理與5%NaOCl 單獨處理的效果相同，DNaseⅠ增加了E.f生物膜對NaOCl的敏感性。NaOCl具有良好的抗菌性，但其濃度越大，細胞毒性越大［18］；同時高濃度的NaOCl若流至根尖周組織或者接觸口腔黏膜會引起劇烈疼痛、感染以及出現腫脹等情況。本研究采取低濃度的0．5%NaOCl溶液與DNaseⅠ聯合應用觀察E.f生物膜去除情況，結果顯示C 組菌量明顯小于E 組，D 組菌量明顯小于A組和E組，但其與B組和C組菌量無明顯差異，同時，B 組、C 組與A 組菌量無明顯差異，證明DNaseⅠ可以聯合Nd：YAP用于輔助沖洗，在聯合使用過程中不會互相影響其清除細菌性能，并能有效提高0．5%NaOCl去除E.f生物膜的細菌量。

Fig．3 CLSM images of E.f adhesion on dentin surface after different ways of processing(SYTO-9/PI staining,×200)圖3 不同方式處理后牙本質表面糞腸球菌E.f黏附的CLSM圖像（SYTO-9/PI染色，×200）

綜上所述，相較單獨使用0．5%NaOCl，DNaseⅠ聯合Nd：YAP激光與0．5%NaOCl進行沖洗能更有效地處理E.f生物膜。本研究為DNaseⅠ與激光聯合應用處理E.f生物膜提供了理論依據，但是具體機制還有待深入研究。